HPLC 法同时测定补肾活血散结胶囊中12 种成分的含量

尹继瑶，胡 静，沈 霞，崔小敏，任 慧，曲 彤，李 宁，鲁文静，陈志永，*，屈 凯，3*

（1.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712083； 2.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003； 3.陕西省中医医院，陕西 西安 710003）

补肾活血散结胶囊（陕药制字Z20130011） 由山茱萸、赤芍、丹参、淫羊藿、熟地黄、菟丝子、金樱子、黄芪、山药、王不留行、姜黄、鳖甲12味中药组成，是由陕西省中医医院临床经验方总结优化而成，功效补肾益气、活血化瘀［1］，用于慢性肾小球肾炎、肾病综合征、慢性肾脏病的临床治疗，也可缓解肾小球硬化、肾间质纤维化等病理状态［2-3］，临床应用多年，疗效显著［1，3-6］。方中君药山茱萸、菟丝子均入肾经，又以温、涩之性味助元气，固肾精［7-8］； 臣以熟地黄补阴血，淫羊藿、金樱子补肾阳，丹参、赤芍、姜黄化瘀血； 佐以黄芪、山药、王不留行、醋鳖甲补脾益肾通经。前期报道，山茱萸中莫诺苷、马钱苷等环烯醚萜类成分可减轻氧化应激损伤，改善肾功能［9-11］； 金丝桃苷作为菟丝子质控指标［12］，可发挥补肾、助阳作用［13］； 朝藿定和淫羊藿苷、芍药苷、丹酚酸类化合物分别是淫羊藿、赤芍、丹参的质控指标［12］。

补肾活血散结胶囊为中药复方制剂，药味繁多，成分复杂，目前仅有1 篇关于其含量测定的报道［14］，为了提高该制剂质量控制水平，本实验采用HPLC 法同时测定没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、丹酚酸B、丹酚酸A、朝藿定C、淫羊藿苷的含量，以期保障其临床有效性、应用安全性。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置VWD 检测器、Agilent Chem Station 工作站（美国Agilent 公司）； KQ-100 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； BS210S 型（精度0.1 mg）、BT25S 型（精度0.01 mg） 电子分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.2 试剂与药物 15 批补肾活血散结胶囊（陕西省中医医院，0.3 g × 45 粒/瓶，批号20201101、20201110、20201201、20201225、20210412、20210603、20210715、20210724、20210929、20211005、20211013、20211226、20220418、20220428、20220506，编号S1 ～S15）。没食子酸（wkq20010905，纯度≥98%）、金丝桃苷（wkq20031109，纯度≥98%） 对照品均购自四川维克奇生物科技有限公司； 原儿茶酸（18082901，纯度≥98%）、紫云英苷 （140712，纯度≥98%） 对照品均购自上海圻明生物科技有限公司； 莫诺苷（P11M11F2846，纯度≥98%）、马钱苷（P10J11F118161，纯度≥98%）、獐牙菜苷（P24O11F128801，纯度≥98%）、丹酚酸 B（P24J11F119380，纯度≥98%）、丹酚酸 A（ A30GB158924，纯度 ≥ 98%）、朝藿定 C（O31GB166249，纯度≥98%） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司； 芍药苷对照品（MUST-17031901，纯度≥99%） 购自成都曼斯特生物科技有限公司； 淫羊藿苷对照品（0737-200111，纯度≥98%） 购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 其余试剂均为分析纯； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相乙腈 （A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～20 min，10% ～20%A； 20 ～30 min，20% ～30%A； 30～40 min，30% ～40%A）； 体积流量1 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长240 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量，置于10 mL 量瓶中，80%甲醇稀释后定容，即得（含没食子酸0.043 mg/mL、原儿茶酸0.018 mg/mL、莫诺苷0.075 mg/mL、马钱苷0.058 mg/mL、獐牙菜苷0.015 mg/mL、芍药苷0.078 mg/mL、金丝桃苷0.015 mg/mL、紫云英苷0.015 mg/mL、丹酚酸B 0.348 mg/mL、丹酚酸A 0.038 mg/mL、朝藿定C 0.015 mg/mL、淫羊藿苷0.040 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 将本品内容物研细，精密称取0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中，50 mL 80%甲醇溶解，称定质量，超声（频率50 kHz，功率300 W） 处理30 min，冷却至室温，80%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照本品处方和工艺，分别制成缺山茱萸（莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷），缺赤芍（芍药苷），缺丹参（丹酚酸A、丹酚酸B），缺淫羊藿（朝藿定C、淫羊藿苷），缺山茱萸、赤芍、金樱子（没食子酸），缺赤芍、丹参、熟地黄（原儿茶酸），缺山茱萸、淫羊藿、菟丝子、金樱子（金丝桃苷），缺淫羊藿、菟丝子（紫云英苷） 的阴性样品，按“2.2.2” 项下方法制备，即得。

2.3 系统适用性考察 取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分可有效分离（分离度均大于1.5），理论塔板数均大于10 000，阴性无干扰，表明该方法系统适用性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.25、0.5、1、2.5、5 mL，80%甲醇定容至10 mL量瓶中，分别取1 mL，在“2.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，并分别以信噪比200 ∶1、10 ∶3 为定量限、检测限，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得各成分峰面积RSD 分别为没食子酸1.36%、原儿茶酸0.77%、莫诺苷0.95%、马钱苷1.00%、獐牙菜苷1.14%、芍药苷0.68%、金丝桃苷0.77%、紫云英苷0.80%、丹酚酸B 1.17%、丹酚酸A 1.28%、朝藿定C 1.63%、淫羊藿苷0.46%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取同一份本品 （S1），按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分峰面积RSD 分别为没食子酸0.92%、原儿茶酸2.49%、莫诺苷0.76%、马钱苷0.64%、獐牙菜苷2.64%、芍药苷0.51%、金丝桃苷1.99%、紫云英苷0.29%、丹酚酸B 1.85%、丹酚酸A 1.31%、朝藿定B 0.77%、淫羊藿苷1.54%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取同一份本品 （S1），按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，测得各成分含量RSD 分别为没食子酸1.28%、原儿茶酸1.12%、莫诺苷1.24%、马钱苷0.84%、獐牙菜苷0.81%、芍药苷0.81%、金丝桃苷2.46%、紫云英苷0.94%、丹酚酸B 1.59%、丹酚酸A 1.92%、朝藿定C 1.46%、淫羊藿苷2.45%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品（批号20211226） 6 份，每份0.25 g，按100%水平精密加入对照品，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、丹酚酸B、丹酚酸A、朝藿定C、淫羊藿苷平均加样回收率分别为99.61%、99.03%、97.11%、98.86%、100.21%、98.87%、101.14%、100.21%、98.12%、100.51%、98.39%、100.75%，RSD 分别为 1.81%、1.39%、1.87%、1.17%、1.82%、2.19%、2.07%、1.07%、0.60%、1.79%、2.65%、1.33%。

2.9 样品含量测定 取15 批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab.2 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝3）

3 讨论

为了优化供试品溶液制备方法，本实验分别考察了超声、加热回流提取，提取时间15、30、45 min［15］，甲醇体积分数60%、80%、100%，考虑到提取效率，最终确定为80% 甲醇超声提取30 min。再分别考察了流动相甲醇-水、乙腈-水，发现乙腈分离效果更优。然后，分别考察了月旭XBC18、Agilent 5 TC-C18色谱柱，发现在后者上各成分色谱峰峰形较尖锐，对称性较好。最后，分别考察了柱温25、30、35 ℃［16］，发现在25 ℃下各成分色谱峰峰形矮小，35 ℃下分离度有所降低，30 ℃下分离效果最佳。

查阅2020 版 《中国药典》 一部［12］和文献［17-20］，发现各成分最大吸收波长在230～270 nm范围内。因此，本实验分别考察了230、240、260、270 nm 下各成分色谱峰出峰情况，发现在240 nm 处分离度较高，出峰较多，峰形最好。

前期报道，莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷为山茱萸指标成分，芍药苷为赤芍指标成分，丹酚酸B、丹酚酸A 为丹参指标成分，朝藿定C、淫羊藿苷为淫羊藿指标成分，没食子酸为山茱萸、赤芍、金樱子共有成分，原儿茶酸为赤芍、丹参、熟地黄共有成分，金丝桃苷为山茱萸、淫羊藿、菟丝子、金樱子共有成分，紫云英苷为淫羊藿、菟丝子共有成分。因此，本实验选择上述12 种成分作为含量测定指标。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定补肾活血散结胶囊中没食子酸、原儿茶酸、莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、金丝桃苷、紫云英苷、丹酚酸B、丹酚酸A、朝藿定C、淫羊藿苷的含量，可实现对方中除姜黄以外其他8 味君药、臣药的定量分析，并且该方法准确、精密、简便，有助于提升该制剂质量控制水平，保证其临床应用的有效性和安全性。