畜禽动物油甘油二酯的酶法制备及应用研究进展

祝超智，郭 旗，赵泽鑫，王卫飞，崔文明，许 龙,*，赵改名,*，李 航

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068；3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；4.河南恒都食品有限公司，河南 泌阳 463700）

与植物油相比，动物油有着特殊的香味，有助于增进消费者的食欲、促进脂溶性维生素的吸收，特别是牛油，因其口感良好、香味宜人，已经成为了川渝麻辣火锅的核心主料。自改革开放以来，我国肉类工业飞速发展，肉制品市场规模显著扩大，取得了举世瞩目的成就。如今，我国已成为世界上肉类年产量最大的国家[1]，2021年我国畜禽肉合计总量为9645万 t，在新冠疫情阶段，我国的肉制品产业仍然保持着强有力的发展势头[2]。作为畜禽肉制品加工的副产物，畜禽动物油脂的年产量巨大，2021年全国牛油的年产量约135～180万 t，猪油约240万 t。

畜禽动物油脂中的饱和脂肪酸质量分数（牛脂约含54%，猪脂约含42%，羊脂约含54%，精炼鹅油约含33%，鸡油约含34.4%）和胆固醇含量（牛脂约含1.53 mg/g，猪脂约含1.10 mg/g，羊脂约含1.10 mg/g）较高，大量研究发现，人体摄入含饱和脂肪酸以及胆固醇高的动物油后，高血脂、高血压及其他慢性心血管疾病的患病率显著上升[3]。这些关于动物油的营养健康问题被报道后，动物油脂在食品工业的应用受到了极大限制，大量高品质的畜禽动物油脂只能用做饲料原料，甚至被当作废料遗弃。如何实现畜禽动物油脂的高值化、合理化利用，成为食品工业中亟待解决的关键问题之一。

功能性结构脂质的合成一直以来被视为油脂行业发展重要方向，1,3-甘油二酯（diacylglycerol，DAG）[4]、LML型结构酯[5]、二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸富集型甘油三酯（triacylglycerol，TAG）[6]和OPO型结构脂[7]等结构脂产品已经实现工业化生产。与化学催化工艺相比，酶法制备具有反应条件温和、专一性强、无毒副产物生成等优势，更能迎合绿色工业的需求[8]。结构脂DAG具有减少内脏脂肪、抑制体质量增加和降低血脂[9]等显著的营养保健功能，已经被美国食品药品监督管理局、日本医师协会和我国国家卫生健康委员会批准为安全食品。近年来关于酶法改性制备DAG的研究大量涌现[10]，其中华南理工大学酶法制备甘油二酯项目率先完成工业化，甘油二酯系列产品已上市流通。借鉴植物油的酶法改性途径，生产功能性的动物油DAG，是实现动物油高值化利用的一种有效有段。本文综述了畜禽动物油DAG的酶法制备及应用研究进展，旨在为动物油脂的合理化利用提供一定的理论支撑和技术参考。

1 畜禽动物油的理化特性、营养功能及加工利用现状

1.1 畜禽动物油的理化特性

可食用畜禽动物油，指的是健康的可食用畜禽经屠宰后，从其卫生安全的脂肪组织经一系列较为成熟的现代化工艺精炼制得的油脂，如牛脂、羊脂、猪脂和鸡油等。精炼动物油色泽洁白或黄白，质地均匀细腻，香味浓郁醇厚。与植物油的甘油酯组成类似，畜禽动物油的主要成分也是TAG，脂肪酸组成主要为饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）（例如棕榈酸、硬脂酸）、单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）（例如油酸）及少量多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）（例如亚油酸、亚麻酸）（表1）[11-13]。因动物油含有大量的SFA，导致其熔点较高（20～50 ℃）（表2），常温下为固体，有着良好的稳定性。动物油还含有大量植物油所不具备的香味成分，如羟类、醇类、醚类、醛类、酮类、羧酸类、胺类、呋喃类等风味物质，这种特殊的香味可以有效增进食欲。此外，相较于植物油的精炼或加工而言，动物油的氢化及精炼脱臭过程不易产生反式脂肪和3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯等有害因子[14]。

表1 一般市售动物油脂肪酸组成及质量分数Table 1 Composition and content of fatty acids in common commercial livestock and poultry fats %

表2 常见畜禽动物油脂的理化指标及主要用途Table 2 Physicochemical indices and applications of common livestock and poultry fats

1.2 畜禽动物油的营养功能

自20世纪50年代起，相继有研究指出，食用饱和脂肪和胆固醇含量高的动物油脂具有诱发心脑血管疾病和癌症等疾病的潜在风险[50-51]，因此，不饱和脂肪酸含量高的植物油成为了消费者烹调用油的首选。然而，近些年来的最新研究表明，适量地摄入动物油脂并不会给人体健康产生威胁[52]，搭配食用植物油和动物油比仅食用植物油有着更好的营养效果。通常，脂肪的摄入应占总能量摄入的30%，其中10%的脂肪应来源于饱和脂肪[53]。其次，控制促炎因子n-6 PUFA与抗炎因子n-3 PUFA的比例对于促进健康具有重要意义，高比例的n-6/n-3 PUFA被认为是癌症和冠心病的潜在风险因素[54]。关于n-6/n-3 PUFA的最佳推荐值，国际上尚无统一标准，但基本都控制在4∶1左右。通常情况下，动物油的n-6/n-3 PUFA比值显著低于植物油，基于此，动物油可能在促进人体健康方面发挥着重要作用。第三，畜禽动物油最大的益处在于其可以为机体提供必需的脂溶性维生素（例如VA、VD、VE、VK），而这些脂溶性维生素的缺乏是夜盲症和佝偻病等疾病的重要诱因。第四，一些畜禽油脂还具有特殊的生理功效，特别是在调控脂代谢与抵抗氧化损伤等方面；张佰帅等[55]证实，鹅油具有调节小鼠血脂代谢的功能，还能够有效抵抗脂质过氧化对细胞的损伤，并起到一定的抗动脉粥样硬化功能；张玉龙[56]发现，鸭油能够有效缓解油酸诱导的HepG2细胞脂堆积、胰岛素抵抗和氧化应激损伤；龙霞等[57]发现，鸭油可能通过激活小鼠肝脏的KELCH样ECH关联蛋白1/核因子E2相关因子2信号通路改善D-半乳糖诱导的氧化应激损伤。

1.3 畜禽动物油的加工利用现状

与植物油的精炼工艺类似，畜禽动物油脂的精炼同样需要进行脱胶、脱酸、脱色和脱臭等处理，以去除其中的残留的蛋白质、磷脂、游离脂肪酸、色素和醛类酮类与低级酸类气味物质，从而得到精炼畜禽动物油。精炼的工艺和标准不同，精炼动物油的成分及其含量也不尽相同，如脂肪酸的含量会在精炼后发生显著变化[58]。

目前，商品化的烹调用畜禽动物油很少，其应用主要体现在以下几个方面。首先，牛脂、猪脂和羊脂等畜禽动物油具有良好的可塑性和起酥性以及特殊的香味，多用于烘焙食品、糕点起酥、人造奶油以及火锅底料等方面。其次，畜禽动物油脂是制备肉味香精的常用原料，常用的制备方法包括可控氧化、氧化-酶解、氧化-美拉德反应和脂肪氧化酶氧化4 种，基于畜禽动物油脂制备的肉味香精香气饱满浓郁，同时可以达到减盐增咸的效果[59]。第三，畜禽动物油被广泛用于结构脂的加工，如MAG[60]、DAG[61]、人乳脂替代品[62]，这些结构脂通常具有特定的理化性质、特殊的生理活性和功能。第四，畜禽动物油可以通过结晶法、乳化法和酯化法制备液化动物油，进而有效促进畜禽动物油脂在食品工业中的应用范围[63]。第五，畜禽动物油可以用于制备粉末化动物油，常用的制备方法包括固化粉碎法、喷雾冷却法、分子微胶囊法、吸附法、喷雾干燥法，这些粉末动物油脂具有受温度影响小、分散性和水溶性好等特点，有助于改善食品的品质，延长保质期[64]。第六，畜禽动物油脂还可以用于开发低胆固醇保健油脂，常用的方法包括β-环糊精包埋法[65-66]和中草药精炼法[67]等，这些低胆固醇动物油可用于曲奇饼干等酥皮类点心的制作，其安全性显著高于植物黄油曲奇饼干[68]。第七，畜禽动物油被广泛应用于制备生物柴油，制备方法包括化学法和生物酶法两种途径[69]，常用的底物包括牛脂[70]、猪脂[71]、鸡油[72]、鸭油[73]和羊脂[74]等，与化石燃料相比，此种方法制备的生物柴油具有可再生、无毒、生物可降解以及润滑特性好等优势。第八，畜禽动物油在日化行业如肥皂、甘油、润滑油和皮革的加工中也应用广泛[75]。用于制备生物柴油和日化行业的畜禽动物油通常来源于一些卫生指标相对较低或炼制工艺比较粗糙的动物油。

2 畜禽动物油DAG

2.1 畜禽动物油DAG的结构特征

DAG的甘油骨架上仅有两个羟基与脂肪酸结合的结构脂。DAG是天然的油脂成分，大多为动植物甘油酯在体内转化的中间体，其在不同动植物中的比例也不尽相同，而且质量分数都很低，一般不超过10%，不易于分离提纯。禽畜动物油DAG具备DAG类油脂的共性特征，可分为sn-1,2-DAG、sn-2,3-DAG和sn-1,3-DAG 3 种立体异构体（图1）。sn-1,3-DAG呈V形构象，而sn-1,2-DAG呈发夹状构象。sn-1,3-DAG在热力学上比sn-1,2(2,3)-DAG更加稳定，所以天然的DAG中sn-1,3 DAG比sn-1,2 DAG的含量高，二者的比例接近2∶1[76]。由于DAG分子结构上有一个裸露的羟基（可作为氢键供体，而TAG无氢键供体），其熔点比相同脂肪酸组成的TAG高（分子间形成氢键所致）。

图1 DAG的分子结构Fig.1 Molecular structure of DAG

据报道，动物油DAG的熔点比其对应的TAG高约5 ℃，且其熔点会随着DAG纯度的升高而升高[77]。此外，动物油DAG的氧化稳定性与DAG的含量呈负相关[78-79]，其黏度低于其对应的TAG[35]。与动物油TAG相比，其对应的DAG晶体颗粒小且分布均匀，晶体网络更加致密，晶型分析显示，动物油TAG主要为β型，因此，口感上表现为粗糙易碎，其对应的DAG表现为β和β’两种晶型共存，且以β’晶型为主，因此口感上较为光滑细腻[77]。

DAG结构的特异性还使其具备了特殊的生理活性。与TAG不同，1,3-DAG经过胰脂肪酶水解后的产物为sn-1(3) MAG、甘油和游离脂肪酸，缺少了TAG在体内再合成的关键底物sn-2 MAG（图2）。因此，摄入1,3-DAG可以增加人体的脂肪代谢，减少TAG的再合成，进而降低血脂水平[80]。除了可以有效预防肥胖外，1,3-DAG还具有促进心血管健康、调节葡萄糖代谢和增加骨密度等功效[81]。

图2 TAG（A）和DAG（B）的代谢途径Fig.2 Metabolic pathways of triacylglycerol (A) and DAG (B)

2.2 畜禽动物油DAG的主要用途

DAG在食品中的应用主要包含以下4 个方面：第一，可以在蛋黄酱和冰淇淋制作中用作乳化剂；第二，可以在人造黄油和起酥油中用作结晶改良剂；第三，可以在肉制品加工过程中作为脂肪替代品；第四，可以代替TAG用作烹调用油。对于畜禽动物油DAG在食品工业中的应用，猪脂DAG和鸭油DAG最为广泛。作为良好的乳化剂，猪脂DAG常被用于乳化肉制品的加工[82]，采用猪脂DAG作为脂肪替代品制备的肉糜具有更好的保水性和弹性，质地更加紧实，不易出现脂肪分离现象[61]。猪脂DAG与肌原纤维蛋白形成的复合胶体比猪脂TAG与其形成的复合胶体具有更高的渗透力和持水性，结构也更加致密有序[83-85]。采用鸭油DAG煎炸的牛肉饼可以显著降低失水率，增加肉质嫩度[35]，鸭油DAG还具有一定的抑菌防腐作用，其与壳聚糖的混合物可以有效延缓肉糜的pH值升高、抑制微生物繁殖和脂质氧化，进而延长肉糜的保鲜期[86-87]，鸭油DAG可以显著提高脱脂奶粉的稳定性，增加香味[88]。

此外，鸭油DAG和鹅油DAG还具有显著的生理活性，特别是1,3-DAG。第一，同植物油DAG一样，畜禽动物油DAG同样具有显著的减肥效果。Wang Baowei[89]和孙宇[90]等发现，鸭油DAG（DAG质量分数分别为94%、86%）可以显著刺激高脂饮食大鼠的脂质代谢，减少脂堆积，从而起到抑制肥胖的效果。第二，畜禽动物油DAG还可以作为具有潜在价值的肠道炎症健康修复剂。刘亚楠等[91]发现，鸭油DAG（质量分数＞85%）与VD3联合使用对结肠炎大鼠的结肠肠道发育具有显著的促进作用；王茜等[92]发现，鸭油DAG（质量分数＞85%）与壳聚糖联合使用可以有效促进溃疡性结肠炎小鼠的结肠组织发育；丛红霞等[93]发现，鸭油DAG（质量分数＞85%）与VK1联合使用可以有效促进溃疡性结肠炎小鼠肠道组织的修复发育；徐慧心等[94]证实，鹅油DAG（质量分数＞92.57%）和天蚕素抗菌肽联合使用同样可以有效治疗小鼠溃疡性结肠炎；谢玉娥等[95]发现，鹅油DAG（质量分数＞90%）有助于优化盲肠微生物的菌群结构，进而调整肠道微生态失调。第三，畜禽动物油DAG在促进骨骼发育方面也表现出一定的效果。刘亚楠等[96]发现，鸭油DAG（质量分数＞90%）与VD3联合使用能够显著提高胫骨的骨密度和骨强度，降低骨源性碱性磷酸酶活性，从而促进胫骨发育。

3 畜禽动物油DAG的酶法制备

3.1 用于DAG制备的酶制剂

DAG的制备方法主要有化学法和生物酶法两种。其中，化学法大多需要高温、强酸强碱、高压等条件，会产生较多有害物质，反应可控性差。相较之下，生物酶法反应条件温和、专一性强、副产物少[97]。作为制备DAG的高效生物催化剂，脂肪酶来源广泛，在动植物和微生物体内均普遍存在。动植物来源的脂肪酶大多存在催化活性单一、产量低、稳定性差、提取成本高等缺点[98]，因此，目前国内外常采用微生物来源的脂肪酶制备DAG[85]。常见的脂肪酶生产菌株包括产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、尼氏芽孢杆菌（Bacillus nealsonii）、球形马拉色菌（Malassezia globosa）、扩展青霉（Penicillium expansum）、木霉（Trichoderma）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、疏棉状嗜热霉（Thermomyces lanuginosus）和南极假丝酵母（Candida antarctic）等[99-104]。因游离酶存在难回收、易失活等缺点，所以工业生产中常需要对脂肪酶进行固定化处理，这些固定化的载体大多为树脂或硅胶等材料。固定化的脂肪酶具有良好的稳定性和环境耐受性，并且易于回收，适用于连续化的工业生产[98]。目前，广泛应用于DAG制备的3 种商品化固定化脂肪酶是由丹麦诺维信公司生产的Novozym 435（来源于南极假丝酵母）、Lipozyme TL IM（来源于疏棉状嗜热霉）和Lipozyme RM IM（来源于米黑根毛霉）。

3.2 酶法制备禽畜动物油DAG的工艺

酶法合成DAG的途径主要包括甘油解、酯化、部分水解和酯交换4 种制备工艺（图3），每一种工艺对脂肪酶催化性质的要求都不尽相同。

图3 DAG的酶法合成途径Fig.3 Enzymatic synthesis pathway of DAG

3.2.1 酶法甘油解反应

第1种常用的DAG制备方法是甘油解反应，该反应是在相对温和的反应温度下通过脂肪酶催化TAG的酰基转移至甘油而合成DAG的一种途径。酶法制备DAG反应具有催化效率高、产物纯度高、副反应少和环境污染小等优点，还可以有效降低缩水甘油酯的产生[105]。然而，在甘油解反应体系中，底物黏度较大，所需反应温度较高，因此脂肪酶的活性会受到一定程度的影响，有时还需要加入溶剂改善体系黏度，然而溶剂的引入会导致产物纯化繁琐。

Yamane[106]和Kang[107]等以氢化牛脂为底物，分别以假单胞菌脂肪酶（EC 3.1.1.3）、Psesudomonas脂肪酶（EC 3.1.1.3）为催化剂，利用甘油解反应制备了氢化牛脂DAG，在最优反应条件下，氢化牛脂DAG的得率分别达到90%（其中1,3-DAG的得率达到95%）和71%。Diao Xiaoqin等[82]以猪脂为底物、Lipozyme RM IM为催化剂，利用甘油解反应制备了猪脂DAG，在最优反应条件下，猪脂DAG的得率达到61.76%，产物经分子蒸馏纯化后，DAG质量分数高达82.03%。赵欣欣等[108]以猪脂为底物，Lipozyme RM IM为催化剂，利用甘油解反应制备了猪脂DAG，研究发现，超声波辅助处理可以显著缩短甘油解反应时间，在最佳超声波辅助条件下，DAG的得率可达46.91%。Cheong[109]和万倪彤[110]等以为猪脂底物、Novozym 435为催化剂，利用甘油解反应制备了DAG，在最优反应条件下，DAG的得率分别达到48%和46%。Miklos等[61]同样以猪脂为底物，Novozym 435为催化剂，利用甘油解反应制备了高纯度DAG，产物经分子蒸馏纯化后，DAG的质量分数高于94%。综上，甘油解反应DAG产物得率约为40%～90%，产物进一步经分子蒸馏纯化后，1,3-DAG质量分数为52%～86%。

3.2.2 酶法酯化反应

第2种常用的DAG制备方法是酯化反应，该反应是以甘油或MAG与游离脂肪酸为底物，在脂肪酶的催化下合成DAG的一种途径，具有反应时间短和产物纯度高等优点，因此，高纯度DAG（质量分数80%）的工业化生产大多通过sn-1,3位选择性强的脂肪酶Lipozyme RM IM催化酯化来实现。然而，直接酯化法的生产成本要比甘油解法的成本高出许多。王宝维等[111-112]分别以鹅油脂肪酸、鸭油脂肪酸和甘油为底物，以固定化CALB为催化剂，以底物比、酶加量、反应时间和温度为考察因素，通过响应面法对鹅油DAG和鸭油DAG的制备工艺进行了优化，在最佳工艺条件下，鹅油DAG和鸭油DAG的得率分别达到92.57%和93.92%。韩海娜[113]以鹅油脂肪酸和甘油为底物，以Novozym 435为催化剂，在最佳工艺条件下（温度46 ℃、时间9.2 h、鹅油脂肪酸∶甘油＝1.12（质量比）、酶添加量3.03%），鹅油DAG的得率达到92.57%。综上，酯化反应的DAG产物得率达到90%以上。

3.2.3 部分水解反应

第3种常用的DAG制备方法是部分水解反应，该反应是利用脂肪酶催化TAG生成DAG、MAG和游离脂肪酸的途径，进而通过分子蒸馏除去水分、MAG、TAG和游离脂肪酸后即可获得高纯度DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作为催化剂，该方法操作简单，且成本较低。孙敏甜[114]以鸡油为底物，以脂肪酶Lvk-01为催化剂，通过部分水解反应制备了鸡油DAG，当酶加量为20 U/g、蒸馏水添加量为15%时，在40 ℃条件下反应2.5 h后，产物中DAG的质量分数达到41.99%（表3）。

表3 酶法改性制备畜禽动物油DAGTable 3 Recent studies on enzymatic production of DAG from livestock and poultry fats

3.2.4 酶法酯交换反应

第4种常用的DAG制备方法是酯交换反应，该反应是以TAG和MAG为底物，在脂肪酶的催化下合成DAG的一种途径，常用脂肪酶Lipozyme TL IM作为催化剂。这种方法主要用于植物油DAG的制备，目前鲜有报道采用此途径合成动物油DAG，由于MAG是一种价格相对比较昂贵的底物，因此，酯交换反应并不具备较好的工业化前景。

3.2.5 其他工艺路径

第5种常用的DAG制备方法是脂肪酶介导的多步级联反应，该方法需要先将油脂通过醇解反应制成脂肪酸乙酯，进而再利用脂肪酶催化脂肪酸乙酯和甘油合成DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作为催化剂。该方法与直接酯化法类似，操作简单，产物得率高。曲可心等[115]先利用化学法将牛脂与乙醇经过乙醇解反应制得牛脂乙酯，进而以牛脂乙酯和甘油为底物，在脂肪酶Lipozyme RM IM的催化下制备了牛脂sn-1,3 DAG，在最佳反应条件下，sn-1,3 DAG的得率达到72.5%，产物经弗罗里硅土提纯后，sn-1,3 DAG质量分数为90.79%。

部分水解反应制备DAG，该方法是利用脂肪酶催化TAG生成DAG、MAG和游离脂肪酸，通过分子蒸馏除去水分、MAG、TAG和游离脂肪酸后即可获得高纯度DAG，常用脂肪酶Lipozyme RM IM作为催化剂，该方法操作简单，且成本较低。

3.3 酶法改性制备禽畜动物油DAG与植物油DAG的对比

通常，畜禽动物油的饱和脂肪酸含量（表1）显著高于植物油的含量，而饱和脂肪酸含量与熔点呈正相关[117]，因此，畜禽动物油的熔点（表2）远高于植物油，室温下呈固态。一方面，固态底物传质效率低；另一方面，脂肪酶为界面酶，固态底物接触面积小，因此，基于固态动物油为底物、脂肪酶为催化剂的反应体系难以在低温条件下实现高效的酶法催化，升高反应体系温度使动物油由固态转化为液态成为了制备动物油DAG的先决条件。然而，多数脂肪酶的最适反应温度低于动物油（特别是牛脂、羊脂和猪脂）的熔点，因此，与植物油DAG的酶法制备不同，制备动物油DAG时尤其要选择温度耐受性高的脂肪酶，例如Novozyme 435、Lipozyme TL IM等。此外，在溶剂体系中（例如正己烷、叔丁醇等）开展动物油DAG的酶法制备也是切实可行的方案，溶剂的引入有助于固态动物油的溶解，从而降低反应体系的温度。

4 结语

畜禽动物油脂的高值化利用一直是困扰畜禽产品加工企业的一大难题，借鉴植物油DAG的产业化加工途径，利用生物酶法制备高附加值的畜禽动物油DAG为实现畜禽动物油脂的高值化利用提供了一个有价值的产业化方向。改性后的畜禽动物油DAG不但可以作为食品工业中优良的乳化剂和脂肪替代品，还可以作为烹调用油使用，此外，一些畜禽动物油DAG还具有特殊的生理功效，如控制肥胖、改善肠道炎症和促进骨骼发育等，因此，这些畜禽动物油DAG甚至有潜力成为保健品行业的新型高端产品。随着畜禽动物油DAG生物酶法加工途径的日渐成熟，其高值化利用必将为畜禽加工企业创收添益。