肾著汤促进小鼠坐骨神经损伤后髓鞘再生作用的研究

接琳琳，于 宁，孙秀玲，张彩霞，张 淼

（1.山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199；2.烟台市烟台山医院妇产科，山东 烟台 264001）

坐骨神经损伤是一种临床常见病，预后差、恢复慢、病后伴长期神经性疼痛，甚至会造成永久性运动能力损伤，给患者造成心理障碍，也给社会带来重大负担[1]。临床对于坐骨神经损伤的治疗方法众多，如西医疗法[2]、中医中药[3]、干细胞[4]等。髓鞘结构异常可导致多种神经系统疾病，如神经病理性疼痛[5]等。雪旺细胞是构成周围神经系统髓鞘的胶质细胞，其形成的髓鞘包膜可促进轴突存活和生长，进而促进损伤神经的修复[6]。Wang等[7]发现姜黄素通过调控RUNX家族转录因子2来增强雪旺细胞的增殖和髓鞘化，进而修复损伤的坐骨神经。

肾著汤记载自《金匮要略》中，又称甘草干姜茯苓白术汤，其组成为甘草、白术、干姜和茯苓，功效为祛寒除湿，主治肾著病。赵天才等[8]认为该病是因素体虚弱、正气不足、滕理不密、卫外不固、寒湿之邪乘虚而入，注于经络、留于关节，使阳气痹阻于腰部而发病。名方选解中有关于肾著汤可用于治疗坐骨神经痛的报道[9]。甘草、白术、干姜、茯苓等四味中药辛温甘淡，方中以干姜为君，取其辛热之性，温中祛寒；以茯苓为臣，淡渗利湿。两者配伍，一热一利，热以胜寒，利以渗湿，寒去湿消，则病本得除。佐以白术健脾燥湿，以助除湿；使以甘草调诸药而和脾胃。四药配合，共奏祛寒除湿之效，寒湿尽去，则冷重自愈。

研究检测应用肾著汤后髓鞘的损伤和再生的表达变化，以期从神经再生和功能恢复的角度分析肾著汤对坐骨神经损伤的作用，为阐明肾著汤在坐骨神经损伤后髓鞘再生机制提供实验依据，并为临床治疗坐骨神经损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和造模肾著汤制备：方剂组成为甘草 6 g、白术 6 g、干姜 12 g、茯苓 12 g，加入1 000 mL水煎至600 mL，分装至于4 ℃冰箱备用。对实验7 d组小鼠灌胃3次/d，早中晚各1次。

造模：24只成年雄性昆明小鼠，研究过程遵循国际通行的动物福利和伦理准则。以随机数字表法分为正常组、对照7 d组（损伤）、实验7 d组（损伤后予以肾著汤灌胃）。正常组不做任何处理，其余2组使用10%水合氯醛进行麻醉后暴露坐骨神经，使用血管钳交替夹住和松开1 cm长坐骨神经3次，夹住10 s后松开30 s，再制作坐骨神经损伤模型。对照7 d组制作坐骨神经损伤模型后，每天正常饲养；实验7 d组在对照7 d组基础上，早中晚各予以灌胃肾著汤。

电镜观察：取材后，一部分坐骨神经使用1%四氧化锇酸固定，用于电镜观察。取小鼠坐骨神经修剪成 1 mm3立方体，在4 ℃的2.5%戊二醛溶液内固定过夜。第2天使用1%四氧化锇酸固定3 h后，依次浸入乙醇、丙酮中，包埋、切片，最后采用铀染色，并于透射电子显微镜下观察。

染色观察：一部分坐骨神经用4%多聚甲醛固定后，进行包埋后切片。伊红染色法（HE染色）：将切片脱蜡处理后放入苏木精水溶液中染色3 min，氨水中分色10 s。流水冲洗后放入酒精中梯度脱水，酒精伊红染色液染色2～3 min，再经二甲苯透明后中性树胶封片。劳克坚牢蓝(luxol fast blue)染色：将切片脱蜡处理后，放入Luxol Fast Blue染色液室温过夜，将切片放入95%乙醇洗掉多余染色液后蒸馏水冲洗。分色液分色15 s后，70%乙醇分色30 s 至灰白质清晰，蒸馏水冲洗，再入伊红染色液体，后脱水、透明，封片。

2 结果

2.1 HE染色观察坐骨神经损伤后髓鞘的形态学改变HE染色中可见正常组坐骨神经髓鞘排列规则紧密，见图1-a；在对照7 d组的坐骨神经中髓鞘出现形态变化，杂乱无章，部分区域出现脱髓鞘现象，见图1-b；实验7 d组髓鞘结构开始修复，髓鞘结构排列较紧密，见图1-c。

图1 HE染色中各组坐骨神经损伤后髓鞘的形态学改变（×400）

2.2 电镜观察坐骨神经损伤后髓鞘的形态学改变电子显微镜图像显示正常组坐骨神经髓鞘呈同心圆层状排列，结构致密且清晰，见图2-a；在对照7 d组的坐骨神经中髓鞘出现形态变化，同心圆层状出现折叠、杂乱无章，部分区域出现空泡、脱髓鞘的现象，见图2-b；实验7 d组髓鞘结构开始修复，髓鞘松解情况改善，见图2-c。

图2 电镜下各组坐骨神经损伤后髓鞘的形态学改变（×400）

2.3 劳克坚牢蓝染色观察坐骨神经损伤髓鞘的改变劳克坚牢蓝染色结果显示，正常组髓鞘呈蓝色，结构清晰完整，无髓鞘脱失，见图3-a；对照7 d组中可见蓝色区域极少，可见广泛性脱髓鞘区域，见图3-b；实验7 d组切片中蓝色区域明显增多，髓鞘结构可见，蓝染髓鞘增多，见图3-c。

图3 劳克坚牢蓝染色中各组坐骨神经损伤后髓鞘的形态学改变（×400）

3 讨论

坐骨神经损伤是临床上一种常见疾病，损伤中可见结缔组织、髓鞘和轴突等多种损伤，通常会导致严重的功能障碍甚至永久性残障。雪旺细胞的高度可塑性是创伤性损伤和周围神经病变后再生的关键因素。较严重的周围神经损伤，如撕脱伤、撕裂伤和挫伤，因介导再生所需的雪旺细胞损伤或死亡而受到影响，甚至由于雪旺细胞再生速度缓慢，远端神经再生可能需要数月或数年，甚至可能最终丧失再生能力[10-11]。尽管现代诊断和显微外科技术进步，但坐骨神经修复后的功能恢复往往不够理想。

现代临床对于坐骨神经损伤治疗手段众多，其中髓鞘的清除和再生是促进神经修复的有效方式。研究发现，在坐骨神经损伤模型中，7，8-二羟基香豆素可促进髓鞘的再生和损伤神经的恢复[12]。香菇多糖主要通过加速雪旺细胞中髓鞘碎片的自噬清除来促进神经再生，这个过程可能受到AMPK/mTOR信号通路的调控[13]。姜黄素可通过调控RUNX家族转录因子2来增强雪旺细胞的增殖和髓鞘化，进而促进损伤坐骨神经的修复[7]。

肾著汤在临床已得到广泛应用，但目前尚无对于肾著汤治疗坐骨神经损伤具体机制的研究。本研究结果显示，应用肾著汤7 d后，髓鞘开始增生，而未用药组髓鞘修复时间则大大延长。现代药理学研究发现，干姜的主要化学成分是以α-姜烯为主的多种挥发油，有抗炎、杀菌等作用[14]，此外在治疗腰椎间盘突出症中发现干姜中的姜黄素既可介导炎症因子的表达，又可激活更多的活性氧和细胞凋亡[15]。茯苓中的三萜类和多糖类物质也有很好的抗炎、增强免疫功能的作用[16]。白术中的白术内酯类在抑制神经细胞凋亡方面具有明显作用，白术内酯Ⅲ可抑制线粒体裂变缓解神经炎症[17]。甘草中的黄酮类化合物具有抗炎、神经保护、提高免疫力等多种作用。肾著汤具有重要的神经保护、抗氧化、抗炎作用，已通过网络药理学在治疗腰椎间盘突出治疗中得到证实[18]。

多种神经系统疾病均伴随髓鞘结构异常，如阿尔茨海默病、佩-梅病和神经病理性疼痛[5]。周围神经如视神经、动眼神经、坐骨神经损伤与修复中，均可见髓鞘结构的改变[19]。

本研究采用小鼠坐骨神经损伤作为周围神经损伤的模型，在HE和电镜下均明显观察到对照7 d组坐骨神经髓鞘出现折叠、杂乱无章甚至脱髓鞘的表现。肾著汤灌胃7 d后髓鞘开始改善，劳克坚牢蓝染色同样可见肾著汤灌胃后蓝染区域增多，与对照7 d组比较，髓鞘再生明显。研究发现，修复型雪旺细胞可通过作用于c-Jun蛋白、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、音猬因子（SHH）的遗传因子、染色质的修饰控制、调节修复程序，促进神经元存活、受损轴突崩解、髓鞘清除、轴突再生并引导至其前靶标，最终促进轴突的再生[20-21]。

网络药理学研究表明肾著汤有重要的神经保护、抗氧化、抗炎的作用[18]，且肾著汤为《金匮要略》[22-25]中用于治疗寒湿滞着下焦所致肾著病的经典名方,其用药组方充分体现了张仲景治病求本、重视脾胃、因证制宜、祛邪安正等治疗思想，而张仲景对于肾著病因病机的剖析以及在详审肾着病机病位后所采用的理中焦、顾下焦的灵活治法，对后世中医临床治疗杂病极具指导意义，值得后辈医者在实际运用中学习借鉴。

综上所述，肾著汤对坐骨神经损伤后髓鞘再生有促进作用，肾著汤的作用机制是今后的研究方向。