羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液对靶动物牛的安全性试验
2024-03-08高馨儿陈玲玲姚学强周凯仁周绪正朱晓鹏张继瑜
高馨儿,陈玲玲,姚学强,周凯仁,王 娟,周绪正,朱晓鹏,张继瑜*
(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃兰州 730050;3.万禾草畜产业科技开发有限责任公司,甘肃张掖 734312)
20世纪80年代开始,羟氯扎胺和左旋咪唑被联合用于蠕虫病的预防及治疗。近年来,羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液及羟氯扎胺左旋咪唑复方片剂已经在许多国家批准上市,且已广泛用于临床驱虫治疗并取得良好的疗效[1]。羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液对牛胃肠蠕虫的疗效试验中,药物组第7天显示出100%有效率,且持续到试验结束(第21天),表明羟氯扎胺左旋咪唑复方药物对于完全和快速去除蠕虫卵具有很高的功效,该药物耐受性良好,在治疗动物中未发现有毒性,有广泛的抗寄生虫活性[2]。本试验参照《兽药临床试验质量管理规范》、《兽药研究技术指导原则汇编》(2006-2011年)及《VICH药物靶动物安全性试验指导原则》的要求设计[3]。通过评估推荐给药量(0.25 mL/kg)的0、1、3、5 倍治疗剂量的羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液在靶动物牛体内的安全性和耐受性,以期为羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液对牛的临床安全用药提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验用动物 试验选用32头10~12月龄健康西门塔尔肉牛,由甘肃省张掖市万禾草畜产业科技开发有限公司提供,体重226~348 kg,雌雄各半。饲养于围栏内,在试验前3个月内未接受任何药物治疗。试验牛可以自由取水,并以不含抗生素的全混合饲料喂养。将32头牛随机分为0、1、3、5倍推荐剂量组,每组8头(雌、雄各4头)。
1.1.2 试验药物 羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液(批号:20210701),浅黄色不透明液体,由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制。
1.1.3 主要仪器 MultifugeX3R低温高速离心机,赛默飞世尔科技中国有限公司产品;ErbaXL-640全自动生化分析仪,德国 ErbaMannbcim 有限公司产品;ProCyte DX全自动五分类血细胞分析仪,爱德士缅因生物制品贸易(上海)有限公司产品;Leica RM2265全自动旋转式组织切片机、Leica HI1210石蜡切片水浴槽和Leica HI1220临床组织病理学烤片台,徕卡显微系统(上海)贸易有限公司产品;BX43+SC50正置显微镜带成像系统,奥林巴斯(中国)有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分组与给药 将32头西门塔尔牛随机分为4组,每组8头,雌雄各半。即对照组0剂量组(0 mL/kg),推荐给药剂量1倍剂量组(0.25 mL/kg),3倍剂量组(0.75 mL/kg),5倍剂量组(1.25 mL/kg)。每头牛有耳标记号,试验牛被随机分成4组,每头牛都有适当的活动范围,每组之间有一定的距离。试验前逐头称重,以体重按剂量口服羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液,连续给药3 d。
1.2.2 血生化检测 在试验开始前(第0天)、给药结束后(第4天)及试验结束后(第18天)分别从试验牛颈静脉采集5 mL血液进行血液生化检测[4]。检查的指标包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总蛋白(TP)白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、肌酐(CR)、甘油三酯(TG)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、葡萄糖(GLU)。
1.2.3 血液学检查 在试验开始前(第0天)、给药结束后(第4天)及试验结束后(第18天)分别从试验牛颈静脉采集5 mL血液于EDTA抗凝采血管。检查的指标包括白细胞计数(WBC)、淋巴细胞(LYM)、单核粒细胞(MON)、中性粒细胞(NEU)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞比容(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、平均血小板体积(MPV)、血小板压积(PCT)。
1.2.4 临床观察 试验过程中每天记录试验牛的体温、呼吸、排泄、饮食及精神状态,观察有无试验牛死亡或其他异常行为,记录异常表现和毒性反应的持续时间。试验开始前记录全部试验牛体重为初始体重,试验结束后记录存活(未剖解)牛体重为最终体重。
1.2.5 病理组织学观察 试验第4天,从0剂量组和5倍剂量组内随机选择4头牛进行安乐死。试验结束后,安乐死0剂量组及5倍剂量组剩余牛。剖检收集心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏样本,眼观有无明显病理变化,将样本储存在10%中性缓冲福尔马林溶液中用于病理组织学观察。
1.2.6 数据处理 将各组试验数据用SPSS 24.0软件进行统计学处理,采用单因素方差分析比较各组间数据差异,所有假设检验均在0.05显著水平进行。结果数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。
2 结果
2.1 临床观察
试验期间未出现牛死亡,1倍、3倍及5倍剂量组多数牛在每次给药后12 h出现腹泻反应,24 h后又恢复到正常;5倍剂量组个别牛出现表情呆滞、食欲减退,但均为暂时性,有明显的时间依赖性,大部分试验牛在给药后12~24 h出现不良反应,停药后随着时间的推移,副作用逐渐减弱或消失;其他剂量组未出现采食、饮水及精神状态明显异常的临床变化。
2.2 对牛体温及体重的影响
各试验组牛体温基本保持平稳,均在正常范围内。试验前及试验结束后对牛进行称重,0剂量组及1倍剂量组试验牛平均体重有所增加, 3倍剂量组及5倍剂量组试验牛体重下降,可能是药物引起的腹泻及应激引起。
2.3 血液学分析
各试验组牛血液学分析见表1和表2。与0剂量组相比,第0天3倍剂量组的红细胞计数(RBC)、红细胞比容(HCT)及平均红细胞血红蛋白含量(MCH),5倍剂量组的红细胞计数(RBC)、红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、血小板计数(PLT)及血小板压积(PCT)差异显著(P<0.05);第4天3倍剂量组及5倍剂量组的嗜碱性粒细胞(BAS)、血红蛋白含量(HGB)、红细胞比容(HCT)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)及5倍剂量组的红细胞计数(RBC)、红细胞平均体积(MCV)差异显著(P<0.05);第18天 3倍剂量组的红细胞计数(RBC)、红细胞平均体积(MCV)及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC),5倍剂量组的血小板计数(PLT)及血小板压积(PCT)差异显著(P<0.05)。试验第4天5倍剂量组红细胞计数(RBC)显著高于对照组且高于正常范围,分析是由于给药导致试验牛腹泻引起的,第18天已恢复至正常范围,其余各项差异显著参数指标均在正常范围内。其他血液学参数指标均无显著差异(P>0.05)。
表1 试验前及试验后各组试验牛血液学检查结果
表2 试验前及试验后各组试验牛血液学检查结果
2.4 血清生化分析
各组试验牛血液学分析结果见表3和表4。与0倍剂量组相比,第0天各试验组血液生化参数指标均无显著差异(P>0.05);第4天3倍剂量组及5倍剂量组的直接胆红素(DBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)及5倍剂量组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(CR)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)均差异显著(P<0.05),5倍剂量组的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)均超出参考范围,表明羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液在5倍临床推荐剂量下对动物的肝肾功能具有一定不良影响,虽然肌酸激酶(CK)同样超出参考范围,但结合其他数据,不能断定肌酸激酶的变化是由肝功能损伤或心肌损伤引起的,其他参数指标虽然与对照组差异显著,但仍在正常范围内;试验结束后,1倍剂量组及3倍剂量组白蛋白(ALB)、5倍剂量组白蛋白(ALB)、肌酐(CR)及肌酸激酶(CK)差异显著(P<0.05)但试验后各组的白蛋白(ALB)及肌酐(CR)均在正常范围内,结合试验前及试验后的数据分析,肌酸激酶(CK)的异常升高应是动物应激所导致的。其他血液生化参数指标均无显著差异(P>0.05)。
表3 试验前及试验后各组试验牛血液生化分析结果
表4 试验前及试验后各组试验牛血液生化分析结果
2.5 病理组织学观察
试验第4天,于0倍剂量组和5倍剂量组内随机选择四头牛进行安乐死(雌雄各半)。试验结束后(第18天),安乐死0倍剂量组及5倍剂量组剩余牛,对安乐死动物进行一般解剖分析,大剂量组与对照组动物均未见明显肉眼可见病变。显微镜观察见图1和图2,第4天镜检可见0倍剂量组试验牛心肌纤维轻微充血及出血,肝脏可见部分肝细胞轻微水泡变性;5倍剂量组试验牛心肌纤维轻微充血及出血,肺泡隔可见充血、部位肺泡隔纤维结缔组织增生,部位肾小管可见轻微肿胀,这些轻微病变可能是由于连续给药及驱逐过程中牛的应激反应导致,其他组织镜检均并未发现明显病理变化。第18天镜检两组均未发现明显病理变化。
图1 第4天0剂量组及5倍剂量组试验牛组织病理学检查结果(HE×200)
图2 第18天0倍剂量组及5倍剂量组试验牛组织病理学检查结果(HE×200)
3 讨论
近年来,由于养殖户不合理用药,导致蠕虫耐药性不断增强,多种药物的治疗效果逐渐变差,寄生虫呈混合感染的现象普遍发生,防控难度越来越大[5]。羟氯扎胺属于水杨酰苯胺类抗寄生虫药,主要用于治疗牛、羊肝片吸虫感染引起的疾病,对绦虫病和线虫病也有良好的治疗效果[6]。左旋咪唑是咪唑并噻唑类抗线虫药[7],具有免疫刺激特性,可增加延迟型免疫反应,并恢复受损的细胞[8]。羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液作为羟氯扎胺及盐酸左旋咪唑两种药物的联合用药,具有疗效高、抗虫谱广、给药便利等优点,是理想的抗蠕虫药优选,具有良好的应用前景。作为在国外已普遍使用的驱虫药之一,目前尚未有该药物产生耐药性的相关报道,选用羟氯扎胺及盐酸左旋咪唑联合用药合理扩大了抗虫谱,对不同蠕虫均有良好的驱虫效果,为蠕虫病防治提供保障,研究表明羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液目前并未产生耐药性[9]。但此前国内并未有经批准的该药物上市,为了促进该药在国内的临床应用研究,靶动物安全性试验是不可缺少的药物临床前关键试验。
本文连续3 d以临床推荐剂量(0.25 mL/kg)的0、1、3、5倍剂量给牛口服羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液,给药后观察14 d,评估药物的安全性。在试验开始前(第0天)、给药结束后(第4天)及试验结束后(第18天)抽取试验牛血液进行血液学检查及血清生化检查。试验第4天,于0倍剂量组和5倍剂量组内随机选择四头牛进行安乐死(雌雄各半),试验结束后安乐死0倍剂量组及5倍剂量组剩余牛,进行病理组织学观察。综合体重,临床毒性观察,血液学检查,血清生化检查和组织病理学检查结果,为药物的临床安全应用提供合理依据。
试验期间所有试验牛体温平稳,未出现异常升高或降低现象,试验结束时,没有牛死亡,除空白剂量组外,其他剂量组给药后12 h多数牛均出现腹泻反应,5倍剂量组个别牛有呆滞、食欲减退表现,但这些不良反应均为暂时性的,停药后随着时间的推移,副作用逐渐减弱或消失,其他剂量组未出现明显临床变化。对试验前、给药后、试验结束后的牛分别进行血液学检查及血液生化分析发现,与对照组相比,试验组部分血液学参数及血液生化参数具有显著差异(P<0.05)但大部分参数指标均在正常范围内,可以忽略不计[10]。在血液生化指标中,谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是评价肝功能敏感的指标,常见于各种肝炎[11-12],第4天5倍剂量组谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)均超出参考范围,表明羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液在5倍临床推荐剂量下对动物的肝肾功能具有一定不良影响[13],肌酸激酶(CK)通常是骨骼肌和心肌损伤最敏感的指标,也是动物应激时最敏感的指标[14],由于肌酸激酶(CK)的异常升高现象自试验开始一直存在,分析其应该是由于驱赶及给药使试验动物持续应激所导致的。病理组织学观察结果没有表现出任何细胞或组织损伤的明显趋势,第4天时试验牛脏器可见不同程度的轻微病变,但第18天时对牛进行病理组织学观察时未发现明显病变,推测第4天时出现的轻微病变是由于给药及驱逐过程中使试验牛产生的持续应激反应所致。
综上所述,使用羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液按5倍临床推荐剂量(1.25 mL/kg)连续3 d口服给药对靶动物牛仍然具有良好的安全性,因此,按临床推荐剂量(0.25 mL/kg)给牛口服羟氯扎胺盐酸左旋咪唑复方混悬液是安全的,且该药物使用安全范围大,适合进行进一步研发。