鸡血藤提取物改善缺血性脑卒中大鼠免疫抑制的作用及对HMGB1/RAGE信号通路介导AQP-4和GAP-43表达的影响

刘芳 吴茜

(武汉市第三医院神经内科,湖北 武汉 430070)

脑血管疾病是一个重大的公共卫生问题。一方面,缺血性脑卒中引起的神经受损会引起多种神经疾病;另一方面,在缺血性脑卒中的急性期和恢复期,患者会出现免疫抑制,而这会引起全身性的感染,极大的影响患者预后〔1,2〕。鸡血藤是草本药密花豆的干燥藤茎,研究已经显示鸡血藤提取物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、镇静等功效,研究表明鸡血藤也具有抗炎和免疫调节的功能〔3,4〕。高迁移率族蛋白(HMG)B1/晚期糖基化终末产物受体(RAGE)是一种损伤相关通路,HMGB1和RAGE可通过多种通路并最终介导炎症反应,从而诱导缺血性脑卒中〔5〕。水通道蛋白(AQP)-4主要存在于脑室周围区域,脑卒中后AQP-4被上调并参与脑水肿的发生〔6〕。以生长相关蛋白(GAP)-43为代表的磷酸蛋白质,主要存在于神经细胞膜,不仅具有高度的特异性,还能一定程度上参与神经突触连接的可塑性和重建及再生及神经系统发育的调控,抑制GAP-43可缓解缺血性脑卒中〔7〕。本研究分析鸡血藤提取物改善缺血性脑卒中大鼠免疫抑制的作用及对HMGB1/RAGE信号通路和AQP-4和GAP-43表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料和器材 雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠(体质量270～290 g,周龄8～10 w,北京维通利华动物公司),ECLIPSE Ni光学显微镜(美国Nikon公司),SAR830/AP呼吸机(美国CWE 公司),流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。苏木素-伊红(HE)染色、末端脱氧核苷酸内切末端标记(TUNEL)凋亡试剂盒(美国罗氏公司),大鼠CD3+、CD4+和CD8+表型抗体试剂(美国Becton Dickinson公司),Trizol试剂(Aidlab公司),实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒(深圳博泰尔生物技术LTD),RNAspin Mini试剂盒(上海创赛科技LTD),兔抗人磷酸化细胞外信号调节激酶(pERK)1/2单抗,兔抗人ERK1/2单抗,羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记IgG二抗购自美国cell signaling公司,电化学发光(ECL)显色试剂盒(浙江联硕生物科技LTD),聚偏二氟乙烯膜(上海鑫华城塑化LTD)等。

1.2大鼠建模、分组和干预 取50只大鼠参照文献〔8〕的方法建立缺血性脑卒中模型〔8〕,具体方法为：首先通过腹腔注射2 ml/kg戊巴比妥将大鼠麻醉,进而将大鼠以仰卧的方式将其固定在试验台上。剔除大鼠颈部毛发,切开右侧颈部皮肤,使右侧颈总动脉暴露,游离右侧颈总动脉和分差,在颈总动脉分叉处插入栓线(4-0单股尼龙线),栓线头距颈总动脉分叉处约18 mm,建立缺血性脑卒中模型成功。在大鼠缺血2 h后,需拔出动脉栓线且对大鼠皮肤进行缝合,进行抗生素的注射以预防因感染出现的实验误差。在建模成功标准方面,以建模2 h后大鼠Longa神经功能评分为标准。在本次实验中建模成功率在90%(45/50)。采用随机数字表法将45只建模成功的大鼠随机分组：模型组、鸡血藤1.5组、鸡血藤3.0组,各15只。另取15只健康大鼠作为对照组,对其仅暴露颈动脉但不结扎。根据参考文献〔4〕,鸡血藤粉末过2号筛后加入30倍(V/V)的80%的乙醇回旋蒸馏提取,将提取液合并后蒸发掉乙醇,用去离子水溶解配制为1 g/ml的母液。大鼠通过鸡血藤提取物灌胃干预,剂量分别为1.5、3.0 g/kg,连续2 w,对照组通过生理盐水灌胃作为对照。

1.3改良大鼠神经功能评分(mNSS)评价 以mNSS系统〔9〕作为评判大鼠神经功能缺损情况的标准,且从感觉、行走、平衡测试、提尾反射、反射缺失及反常运动6个方面,总评分0～18分,0分表示无神经功能损害,评分越高则在损害程度方面越严重,且在此过程中由1位研究者进行mNSS。

1.4HE染色 大鼠安乐死后收集脑组织,通过使用HE染色的方法,对其脑水肿边缘组织的病理变化进行检测。首先将脑组织样品通过甲醛溶液进行固定,再进行流水冲洗后使用不同浓度的乙醇进行脱水处理,进而将样品组织浸入蜡后切成小块。进一步的将其脱蜡后进行HE染色。且将细胞核使用苏木素,细胞质使用伊红分别进行染色1～2 min,将细胞进行切片脱水处理后通过显微镜观察。

1.5TUNEL染色 首先使用二甲苯对切片的脑组织重复脱蜡处理2次,每次不少于10 min,进而使用乙醇法进行脱水处理,并在一定温度条件下对其使用反应溶液处理,加入链霉亲和素-HRP后进行孵育及脱水脱色等操作。通过光学显微镜对细胞凋亡情况进行观察,同时计算细胞凋亡指数。

1.6RT-qPCR 使用RNeasy Mini试剂盒以Trizol法对脑组织过总RNA进行提取,检测RNA的完整性和浓度后,逆转录cDNA,同时,反应条件保持在37 ℃ 15 min及98 ℃ 5 min。进而使用BestarqPCR预混液行PCR扩增,反应条件为95 ℃ 60 s,94 ℃ 30 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 60 s;72 ℃下延伸4 min,重复上述步骤40个循环左右。通过Agilent Stratagene Mx3000P序列检测系统进行qPCR分析,同时将GAPDH内部参照,分别对AQP-4、RAGE、HMGB1、GAP-43 mRNA相对表达水平进行计算。

1.7Western印迹检测RAGE等蛋白 取各组脑组织,快速将其置于预冷的RIPA蛋白裂解中进行脑组织裂解后,60 s后进行离心,4 ℃,12 000 r/min离心15 min,获取并收集总蛋白,检测蛋白定量后置于-80 ℃冰箱中冰冻保存。取蛋白质通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,转移至硝酸纤维素膜上,在一定环境下将其浸入脱脂牛奶进行封闭处理,进而加入兔抗鼠一抗体、二抗在一定温度条件下进行孵育,同时化学发光试剂处理。将GAPDH用于本次研究所使用的内参,通过Quantum One软件分析灰度对AQP-4、RAGE、HMGB1、GAP-43蛋白表达量进行计算。

1.8流式细胞术 大鼠摘眼球取外周血,使用密度梯度离心将浸润的淋巴细胞进行局部分离,首先将其制备获取单个淋巴细胞悬浮液并使用PBS对样品细胞进行固定处理,30 min左右使用缓冲液重复清洗2次后收集细胞。将细胞加入通透缓冲液中避光孵育30 min后缓冲液清洗。在室温下孵育细胞和小鼠CD3+、CD4+和CD8+表型抗体试剂及对照抗体30 min后用缓冲液洗掉抗体,用缓冲液重悬细胞,再用流式细胞仪检测CD3+、CD4+和CD8+淋巴细胞亚群的百分比。

1.9统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠mNSS的影响 4组mNSS差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组〔(0.00±0.00)分〕比较,模型组mNSS〔(9.78±1.36)分〕显著升高(P<0.05);与模型组比较,鸡血藤1.5组mNSS〔(7.12±0.95)分〕显著降低(P<0.05);与鸡血藤1.5组比较,鸡血藤3.0组mNSS〔(4.16±0.92)分〕显著降低(P<0.05)。

2.2鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠病理学改变的影响 对照组神经元分布均匀,细胞核结构清晰。模型组细胞核染色变深并且出现间质性水肿。鸡血藤1.5组神经元损伤和水肿情况轻于模型组,并且鸡血藤3.0组脑组织损伤情况较鸡血藤1.5组轻,见图1。

图1 各组脑组织(×400)

2.3鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠脑组织细胞凋亡的影响 4组脑组织细胞凋亡率有统计学意义(F=38.256,P<0.001)。模型组细胞凋亡率〔(36.27±3.41)%〕显著高于对照组〔(8.03±1.10)%,P<0.05〕,鸡血藤1.5组细胞凋亡率〔(23.09±1.96)%〕较模型组显著降低(P<0.05),鸡血藤3.0组细胞凋亡率〔(12.35±0.82)%〕显著低于鸡血藤1.5组(P<0.05),见图1。

2.4鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠脑组织中HMGB1/RAGE通路的影响 4组脑组织中HMGB1/RAGE通路水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组、鸡血藤1.5、3.0组HMGB1、RAGE mRNA和蛋白表达明显高于对照组(P<0.05);且鸡血藤1.5、3.0组HMGB1、RAGE mRNA和蛋白表达较模型组显著降低(P<0.05);与鸡血藤1.5组比较,鸡血藤3.0组HMGB1和RAGE mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.05),见图2、表1。

表1 各组脑组织中HMGB1/RAGE通路及AQP-4、GAP-43 mRNA及蛋白表达

图2 Western印迹检测各组HMGB1和RAGE蛋白表达

2.5鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠脑组织中AQP-4和GAP-43表达的影响 模型组、鸡血藤1.5、3.0组AQP-4、GAP-43 mRNA及蛋白水平显著高于对照组;且鸡血藤1.5、3.0组上述指标明显低于模型组(P<0.05),鸡血藤3.0组上述指标显著低于鸡血藤1.5组(P<0.05),见表1、图3。

图3 Western印迹检测各组AQP-4和GAP-43蛋白表达

2.6鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠T淋巴细胞亚群的影响 模型组、鸡血藤1.5、3.0组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值显著低于对照组(P<0.05),模型组CD8+明显低于对照组(P<0.05);鸡血藤1.5、3.0组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均显著高于模型组(P<0.05),鸡血藤3.0组CD3+、CD4+和CD4+/CD8+比值均显著高于鸡血藤1.5组(P<0.05),见表2。

表2 鸡血藤对缺血性脑卒中大鼠T淋巴细胞亚群的影响

3 讨 论

缺血性脑卒中会导致血液灌注障碍,诱发氧化应激反应和自由基清除变慢,从而诱发脑水肿,并导致炎性反应和神经元凋亡。研究显示脑损伤也会引起机体免疫力的降低,特别是严重神经损伤或者昏迷的患者,其脑损伤后会出现交感神经系统的激活,从而引起免疫抑制〔10〕。免疫抑制不但会导致机体中炎性反应的难以控制,并会影响预后。

近年来中药在缺血性脑卒中和免疫调节中的作用受到广泛关注。鸡血藤是一种传统中药,味苦、甘,性温,具有活血补血,舒筋活络等功效,报道显示,鸡血藤提取物具有广泛的生物活性,包括镇静、消炎、免疫调节、凋亡调节〔11〕。研究显示,鸡血藤提取物不仅能够改善局灶性缺血现象,还能够一定程度上对再灌注损伤的神经元起到一定保护作用〔12〕。一项中药数据挖掘分析结果显示鸡血藤中的活性物质能够治疗缺血性脑卒中〔13〕。结合文献报道和本研究结果,说明鸡血藤能够保护缺血性脑卒中引起的神经元损伤和凋亡。

此外,本研究结果还显示,鸡血藤能够显著抑制HMGB1/RAGE通路及AQP-4、GAP-43的转录和翻译水平。HMGB1是一种核染色质蛋白,在所有细胞中普遍表达,HMGB1还参与信号通路的转导并诱发炎性反应〔14〕。HMGB1可以通过RAGE将信号传递至细胞核并诱导炎性细胞因子的表达,从而引起神经元损伤,而抑制HMGB1/RAGE通路可缓解脑损伤相关的神经元凋亡〔15〕。AQP-4是HMGB1/RAGE通路下游的验证标志蛋白,也是脑组织中炎性反应的重要标志蛋白,研究显示,急性缺血性脑卒中患者的AQP-4与氧化应激诱导的血脑屏障破坏和神经元损伤有关,AQP-4水平可反映脑神经损伤程度〔16〕。而GAP-43蛋白不仅在神经细胞生长、增殖、凋亡中发挥重要作用,同时还参与神经兴奋性和神经元突触形成的过程〔17〕,在缺血性脑卒中后脑脊液中,GAP-43浓度的瞬时增加可反映神经元损伤程度,帮助在蛋白水平上评估鸡血藤对脑卒中大鼠神经的保护作用〔18〕。本研究结果显示,鸡血藤提取物能够显著抑制HMGB1/RAGE通路,并降低AQP-4、GAP-43转录和翻译水平。本研究结果表明,在脑卒中模型中,HMGB1/RAGE通路被激活并诱导炎性反应,导致AQP-4蛋白及炎性细胞因子的表达,引起神经元凋亡和GAP-43蛋白降低,而鸡血藤提取物则可在mRNA和蛋白水平上抑制HMGB1/RAGE通路,进而抑制AQP-4转录和蛋白表达,抑制炎性反应,促进GAP-43表达缓解神经元损伤。

在缺血性脑卒中急性期,某种情况下会造成先天免疫细胞进入到患者大脑及脑膜,从而造成一定程度上的缺血性损伤,但也可能具有保护作用。同时,受损脑细胞释放到循环系统中的危险信号会激活全身免疫,继而导致严重的免疫抑制,从而导致危及生命的感染〔19〕。而在疾病初期阶段,由于抗原呈递给大脑造成了一定的适应性免疫抑制反应,这可能是神经精神后遗症的基础,也是脑卒中后神经相关并发症发生的重要原因〔20〕。作为机体免疫至关重要的组成部分,T淋巴细胞与脑卒中患者的康复和肺部感染的发生有关。研究显示,脑卒中患者较对照组CD3+和CD4+/CD8+水平均明显降低,而且其是患者发生肺部感染的独立危险因素〔21〕。临床研究结果也显示,CD3+和CD4+/CD8+比值的提高与脑血管疾病患者疗效的提高有关〔22〕。黄诗琦等〔23〕研究结果显示,鸡血藤中的活性物质能够提高小鼠免疫力,从而治疗大肠杆菌引起的败血症。本研究结果显示,鸡血藤提取物不但能够保护缺血性脑卒中引起的神经元损伤和凋亡,还能够解除免疫抑制。

但是本研究也有一定的局限性,首先,鸡血藤对脑卒中的缓解作用仍需要临床研究证实,并且其通过HMGB1/RAGE通路保护脑神经的机制仍需要抑制剂来验证,但是由于HMGB1/RAGE通路激活剂的缺乏,这部分实验可能在未来完成。此外,鸡血藤解除免疫抑制的作用是否与其神经保护作用有关仍需要进一步探究,鸡血藤提取物中何种物质发挥保护作用仍不清楚。