EZH2在前列腺癌中表达及其抑制剂对前列腺癌细胞生物行为学的影响

周擎宇 姜华茂

(锦州医科大学附属第一医院泌尿外科,辽宁 锦州 121001)

前列腺癌属于男性泌尿系统恶性肿瘤,其具有发病率高、起病隐匿等特点,治疗方式主要为放化疗,但其生存率较低,因此对前列腺癌的发生、发展机制进行探究对诊断及治疗意义深远〔1～7〕。zeste基因增强子同源物(EZH)2在癌症中上调,与癌症的发展关系密切,研究证实,EZH2在肿瘤患者中过表达表示预后较差,可促进乳腺癌、结肠癌等细胞增殖〔8,9〕。EZH2对肿瘤具有促进作用,因此对于EZH2抑制剂的研究不断深入。EZHZ甲基转移酶抑制剂(GSK126)属于新型抑制剂,抑制EZH2功能,阻碍甲基化组蛋白H3(H3K27)甲基化,发挥抗肿瘤的效果〔10〕。EZH2在前列腺癌的进展中作用较为重要,但具体作用机制尚不清晰,基于上述研究背景,本研究对前列腺癌组织及细胞中EZH2进行检测,并探讨EZH2抑制剂干预前列腺癌细胞,对其增殖、凋亡的影响及可能的作用机制。

1 对象与方法

1.1研究对象 于2018年4月至2020年10月锦州医科大学附属第一医院经病理学诊断确诊为前列腺癌患者20例,并进行手术切除得到20例前列腺癌组织标本及20例癌旁组织标本;年龄42～65岁,平均年龄(52.64±6.97)岁。患者均知情,自愿参与,未接受过内分泌治疗、放化疗。

1.2仪器、试剂及细胞培养 将获得的前列腺癌组织标本及癌旁组织标本放置于液氮中保存。前列腺正常细胞RWPE-1及前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145细胞系均购自中科院上海细胞所。主要仪器及试剂盒厂家：GSK126购自美国Selleck生物科技有限公司;噻唑蓝(MTT)试剂购自北京博奥拓达科技有限公司;逆转录试剂盒、荧光定量聚合酶链反应(PCR)试剂盒购于TaKaRa公司;流式细胞仪购自美国BD公司;B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、Bcl-2、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、哺乳动物雷帕霉素蛋白(mTOR)一抗、二抗均购自美国Santa Cruz,RPMI1640培养基购自Invitrogen公司。正常前列腺上皮RWPE-1细胞、前列腺癌PC-3、LNCaP和DU145细胞培养于RPMI1640培养基中,37 ℃、5% CO2的培养箱中培养,融合度70%～80%,胰蛋白酶消化,传代培养。

1.3细胞转染 取对数生长期PC-3细胞,以1×105个/ml接种96孔培养板,随机分为4组,分别为对照组、低、中、高剂量GSK126组,对照组细胞不做处理,低、中、高剂量GSK126组细胞分别应用EZH2抑制剂GSK126,溶解于DMSO,稀释到所需终浓度5、25、50 μmol/L,溶于培养基中,细胞传代、换液均加入GSK126,维持7 d后,取各组对数生长期细胞进行实验。

1.4荧光定量PCR检测 取癌组织、癌旁组织及转染7 d的细胞,Trizol提取总RNA,二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒检测浓度、纯度。获取cDNA,根据试剂盒说明书进行扩增,反应条件：94 ℃变性30 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸45 s,共35个循环;引物序列：EZH2上游引物5′-GTTGGCGGGA AGCGTGTAAAGACT-3′,下游5′-GTATCCTTCGCTGCTTCCATTC-3′,β-actin上游引物5′-TTGCTGACAGGATGCAGAAG-3′,下游5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGT-3′,以β-actin为内参,2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.5细胞增殖 收集干预后各组PC-3细胞,调整细胞密度,1×105个/孔接种培养板,常规培养12、36、72 h后,收集细胞,5 g/L的MTT溶液20 μl,孵育4 h,弃上清,加二甲基亚砜200 μl,反应后,检测各组吸光值(OD值),实验重复3次。

1.6细胞凋亡 分别取转染7 d后各组PC-3细胞,按照说明书进行步骤操作,流式细胞仪对各组细胞的凋亡情况进行检测。实验重复3次。

1.7Western印迹检测蛋白相对表达 Western印迹检测Bax、Caspase-3、Bcl-2、PI3K、AKT、mTOR蛋白相对表达量,将各组细胞接种到6孔板,加入细胞裂解液,裂解细胞,收集上清液;BCA检测蛋白浓度,30 μg蛋白样品,进行电泳,室温下孵育1 h,加入兔抗Bax、Caspase-3、Bcl-2、P13K、AKT、mTOR及GADPH多克隆抗体溶液4 ℃冰箱孵育过夜,第2天室温孵育二抗,重复试验3次,分析条带灰度值。

1.8统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行配对t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1EZH2在前列腺癌组织及前列腺癌细胞中的相对表达 前列腺癌组织EZH2的相对表达量较癌旁组织明显升高(2.36±0.35 vs 1.02±0.03,t=17.060,P=0.001,n=20)。前列腺癌PC-3、LNCaP、DU145细胞和前列腺上皮RWPE-1细胞中EZH2表量分别为2.39±0.31、1.87±0.12、2.03±0.16、1.05±0.04。与前列腺上皮RWPE-1细胞相比,前列腺癌细胞中EZH2的表达水平均上升,差异有统计学意义(F=20.340,P<0.001)。在3种前列腺癌细胞中,PC-3细胞中EZH2表达水平显著高于LNCaP细胞(n=10,t=4.947,P<0.05)、DU145细胞(t=7.034,P<0.05)。后续研究采用PC-3细胞。

2.2不同剂量EZH2抑制剂GSK126对PC-3细胞增殖的影响 如表1所示,与对照组相比,低、中、高剂量GSK126组前列腺癌PC-3细胞中EZH2的相对表达水平均降低,中剂量GSK126组降低较其他两组更为明显,具有统计学差异(P<0.05)。可见应用EZH2抑制剂GSK126后,成功下调EZH2在PC-3细胞中的表达。转染12、36和72 h后,与对照组相比,低、中、高剂量GSK126组OD值均升高,中剂量GSK126组降低较其他两组更为明显,具有统计学差异(P<0.05)。表明应用EZH2抑制剂GSK126后对PC-3细胞的增殖能力有明显的抑制作用。

表1 不同剂量EZH2抑制剂GSK126对PC-3细胞增殖、凋亡的影响

2.3不同剂量EZH2抑制剂GSK126对PC-3细胞凋亡的影响 如表1、图1、图2所示,与对照组相比,低、中、高剂量GSK126组凋亡率及凋亡蛋白Bax、Caspase-3均升高,Bcl-2降低,中剂量GSK126组较其他两组效果更为明显,具有统计学差异(P<0.05)。表明应用EZH2抑制剂GSK126后可促进PC-3细胞凋亡。

图1 各组PC-3细胞凋亡(Tunel染色,×200)

2.4PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白相对表达量 如表2所示,与对照组相比,低、中、高剂量GSK126组P13K、AKT、mTOR蛋白相对表达均较低,中剂量GSK126组降低较其他两组效果更为明显,具有统计学差异(P<0.05)。表明应用EZH2抑制剂GSK126后可抑制PC-3细胞PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白表达。

表2 各组PI3K-AKT-mTOR信号通路相关蛋白相对表达量

3 讨 论

EZH2是属于组蛋白甲基转移酶,其在前列腺癌中可能是通过调控组蛋白甲基转移酶活性介导转录抑制,与转录因子结合,高表达,促进细胞增殖〔11,12〕。EZH2在前列腺癌细胞中表达较高时,较多抑癌基因被抑制,提示EZH2属于抑制因子,抑制转录〔13〕。本研究结果显示,前列腺癌和细胞中EZH2均呈现高表达,经EZH2抑制剂GSK126干预后,细胞的增殖抑制,细胞凋亡增强,以中剂量效果较为显著,EZH2抑制剂GSK126通过抑制EZH2表达,促进抑癌基因表达,进而减弱细胞增殖。

抗凋亡属于肿瘤治疗较为重要,研究认为细胞凋亡有两条路径：内源性及外源性凋亡途径〔14〕。内源性凋亡中细胞色素C释放较为重要,抗凋亡Bcl-2家族分子和促凋亡分子Bax之间的平衡失调。Bcl-2家族在内源凋亡途径中,对线粒体依赖进行调节〔15〕。Bax是促凋亡因子,致线粒体膜电位降低,细胞色素释放,细胞凋亡〔16〕。并且上述两条路径会激活Caspase-3。Caspase-3被认为是凋亡的执行者,活化后可诱导细胞凋亡〔17〕。Bax、Caspase-3在前列腺癌细胞中表达较低,Bcl-2表达较高,本研究表明,EZH2抑制剂GSK126可作为治疗前列腺癌的潜在药物靶点。

PI3K-AKT-mTOR通路参与细胞周期进程、通过AKT调控凋亡蛋白,从而抑制细胞凋亡,激活的PI3K-AKT-mTOR通路在前列腺癌的发生发展中作用较为重要〔18〕。研究表明,前列腺癌中PI3K-AKT-mTOR通路处于激活状态,可促进肿瘤增殖,蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的突变可促进PI3K/Akt信号通路激活,调节下游mTOR蛋白,对细胞生长及功能进行调控〔19〕。研究显示,EZH2表达与PI3K/AKT信号通路密切相关,对细胞增殖及周期具有一定的影响力〔20〕。本研究说明,EZH2抑制剂GSK126可抑制P13K-AKT-mTOR信号通路激活,但要注意剂量。mTOR蛋白及其下游相关蛋白表达可上调PI3K/AKT信号通路从而影响前列腺癌细胞的生物学行为,PI3K激活后,细胞增殖,EZH2调节AKT的磷酸化进而参与前列腺癌发生进展〔21〕。

综上,EZH2抑制剂GSK126具有抑制结肠癌细胞中EZH2表达、细胞增殖及促进细胞凋亡作用,其作用机制可能与PI3K-AKT-mTOR信号通路有关,但仅为本文研究结果,EZH2抑制剂GSK126是否可通过其他信号通路途径调节前列腺癌细胞EZH2表达及增殖凋亡并未分析,因此,后续仍需进一步验证,充分挖掘EZH2抑制剂GSK126的医用价值,为前列腺癌的研究提供新方向。