基于Caspase3探讨余甘子叶提取物对慢性阻塞性肺疾病大鼠气道高反应、肺泡上皮细胞活性的影响及作用机制

张爱军 刘渊勇 于丽君 冯平

(1唐山市第三医院,河北 唐山 063000;2河北北方第一附属医院)

慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)是一种以气流受限为特征的进行性肺部疾病,其起病缓慢,病程较长,早期通常没有自觉症状,随病程的发展可出现慢性咳嗽、咳痰、气短、胸闷等症,这对患者的日生活质量造成了极大影响〔1〕。目前慢阻肺的确切病因尚不明确,但有研究表明,其与气道炎症密切相关,而气道炎症通常会引起气道高反应,从而使气道阻力增大,进而引发咳嗽、气短、胸闷等症状,严重者可能会出现直接危及患者生命安全的寂静肺,因此如何抑制气道高反应已经成为目前医学领域关注的焦点之一〔2〕。肺损伤在慢阻肺中极为常见,严重者可导致急性呼吸窘迫综合征,甚至多器官衰竭,而有研究表明,慢阻肺肺损伤主要是由于炎性介质等所引起的肺泡上皮细胞凋亡,其可导致肺屏障损伤,从而出现肺泡出血、肺间质水肿及中性粒细胞浸润增加等现象,进而导致肺部炎症加重,最终促进疾病发生、发展,故如何改善肺泡上皮细胞活性是目前临床工作的重点之一〔3〕。而胱天蛋白酶(Caspase)3是凋亡过程重要的执行者,是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路,其一旦被激活,蛋白酶级联反应就会被启动,从而放大凋亡信号通路,加速细胞凋亡,故其可能在慢阻肺的发生发展中扮演重要角色〔4〕。抗菌药物是临床慢阻肺最为常用的治疗方式,但长期使用可能导致免疫力下降,最终甚至可能导致肺部感染〔5〕。研究表明,中药在治疗慢阻肺方面疗效显著,因此受到愈来愈多的研究人员关注〔6〕。余甘子叶是我国传统中药,其具有广泛的药理作用,可健胃消食、化痰止咳、保肝解毒、清热生津,此外其在抗菌方面也发挥着重要作用,因此被广泛应用于临床治疗中〔7〕。但其是否对慢阻肺具有治疗作用尚不清楚,本文基于Caspase3探讨余甘子叶提取物对慢阻肺大鼠气道高反应及肺泡上皮细胞活性。

1 材料与方法

1.1动物材料 本实验选取深圳华大基因股份有限公司提供的60只SPF级SD雄性大鼠,平均体质量170～210 g,室温生长,模仿昼夜交替,在常温下进行无菌饮食2 w,按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2实验材料 余甘子叶提取物(货号：128,西安金绿有限公司);乙酰半胱氨酸颗粒(富露施,货号：国药准字H20030732,广东百澳药业有限公司);Caspase3抑制剂(Z-DEVD-FMK,货号：HY-12466,MedChemExpress LLC);香烟发生器(型号：RC-200,上海玉研有限公司);脂多糖(货号：FT031030,上海梵态有限公司);电子分析天平(型号：FA2004N,上海菁海有限公司);无创肺功能仪(型号：PLY,上海玉研有限公司)低温冷冻离心机(型号：Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);苏木素-伊红(HE)染液(货号：BIR615,北京博尔西有限公司);光学显微镜(型号：TS2009,河南云飞有限公司);TUNEL试剂盒(货号：ATK00001,武汉益普有限公司);免疫组化试剂盒(货号：YDDEF001,上海羽哚有限公司);Caspase3抗体(货号：PL0403200,深圳豪地华拓有限公司)。

1.3建模 50只SPF级SD雄性大鼠,使用专门的烟雾暴露装置,将大鼠放置在闭合的空间内,暴露于烟雾中30 d,然后腹腔注射脂多糖10 mg/kg,6 h后大鼠出现明显咳嗽、胸闷气短、呼吸困难等症状,视为建模成功,均造模成功。

1.4分组及给药 50只建模成功的大鼠中随机分为模型(B)组、富露施(C)组、余甘子叶提取物(D)组、Caspase3抑制剂(E)组、余甘子叶提取物+Caspase3抑制剂(F)组,每组10只,同时随机选取10只正常大鼠作为正常对照(A)组,C组灌胃50 g/kg富露施,D组灌胃50 mg/kg余甘子叶提取物,E组灌胃10 μg/kg Z-DEVD-FMK,F组给予余甘子叶提取物联合Z-DEVD-FMK,两组均1次/d,持28 d,A、B组同期灌胃同体积生理盐水。

1.5大鼠气道高反应检测 建模完成后,对各组大鼠进行气道高反应检测,首先连接好无创肺功能仪并定标,然后将大鼠放到体积描记箱中,用Buxco系统测定大鼠气道阻力,严格按照程序操作步骤,最后通过信号采集器采集数据并记录。

1.6标本采集 气道高反应实验完成后,麻醉处死大鼠并称重,然后取双肺,电子天平称重以计算肺体脂数(LBF),取大鼠右肺用干净滤纸沾干右肺表面水分再次称重,70 ℃烘箱烘干72 h称重,用干湿重法测定肺含水量(LWC)。左肺组织固定48 h,常规石蜡包埋、切片,放入冰箱中密封保存。

1.7大鼠病理组织HE染色 取各组肺组织,流水冲洗,用无水乙醇浸泡5 min,95%的乙醇浸泡5 min,75%的乙醇浸泡5 min,蒸馏水洗涤2次,用苏木素浸染15 min,蒸馏水冲洗30 min,用0.5%伊红乙醇溶液染色3 min,蒸馏水洗涤后,脱水、透明、中性树胶封片处理,光学显微镜观察。

1.8TUNEL法检测肺泡上皮细胞凋亡 取左肺组织切片浸入二甲苯中,脱去石蜡,将切片依次浸入绝对乙醇、95%乙醇、80%乙醇和去离子水中,每个液体中浸泡5 min,将切片放入蛋白酶K溶液中,浸泡10～20 min,用磷酸盐缓冲液洗涤切片3次,每次约5 min,用TUNEL封闭液封闭切片,浸泡30 min,将切片转移到TUNEL反应液中,37 ℃浸泡1 h,将切片洗涤3次,每次5 min,用去离子水洗涤1次,每次5 min。将切片放入染色剂4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色20 min至半小时,将切片放入去离子水中,轻轻晃动几次,然后放在纸巾上吸干余液,将切片置于显微镜载玻片上,在切片上方放置一个小滴无氧溶剂并覆盖玻片,使用共聚焦显微镜观察切片。

1.9免疫组化法检测Caspase3蛋白表达 取各组肺组织,用二甲苯进行两次脱蜡,每次20 min,再用乙醇进行梯度浸泡水化,冲净并擦干后用过氧化氢温室孵育10 min,PBS冲洗3次,用柠檬酸盐缓冲液进行微波热修复,2%BSA封闭30 min,加入稀释的Caspase3一抗(1∶200),4 ℃过夜后洗膜;加入稀释的生物素标记的二抗(1∶200),37 ℃水浴30 min;洗膜后,用DAB进行显色,PBS洗涤3次,苏木素复染后中性树胶封片,光学显微镜观察,计算机病理图像处理系统进行半定量测定。

1.10统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行t检验、χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组气道高反应 与A组比较,B组气道阻力明显升高(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F组气道阻力明显降低,且D组比C组降低显著(P<0.05),E组与D组相比无明显差异(P>0.05),F组比E组降低显著(P<0.05),见表1。

表1 各组气道阻力、LBF、LWC含量、凋亡率及肺组织caspase3蛋白表达比较

2.2各组LBF及LWC含量 与A组比较,B组LBF、LWC含量明显升高(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F组LBF、LWC含量明显降低(P<0.05),且D组比C组降低明显(P<0.05),E组与D组无明显差异(P>0.05),F组比E组降低更显著(P<0.05),见表1。

2.3各组肺泡上皮细胞凋亡结果 与A组相比,B组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F组细胞凋亡率明显降低,且D组比C组降低显著(P<0.05),E组与D组无明显差异(P>0.05),F组比E组降低显著(P<0.05),见表1、图1。

图1 各组细胞凋亡(TUNEL染色,×400)

2.4各组肺组织Caspase3蛋白表达 与A组相比,B组肺组织Caspase3蛋白表达明显升高(P<0.05);与B组比较,C、D、E、F组肺组织Caspase3蛋白表达明显降低(P<0.05),且D组比C组降低显著(P<0.05),E组与D组无明显差异(P>0.05),F组比E组降低显著(P<0.05),见表1、图2。

图2 各组Caspase3蛋白表达(免疫组化,×200)

2.5各组肺组织HE染色 A组支气管、肺泡正常完整,间质均匀无充血,未见炎性细胞浸润;B组支气管上皮破坏程度减少,可见明显水肿出血,肺间质明显增厚,且有大量炎细胞浸润;与B组比较,C、D、E、F组病理形态明显改善,见图3。

图3 各组肺组织结构(HE染色,×200)

3 讨 论

慢阻肺是在全球范围内非常常见,是导致死亡和残疾的主要原因之一,根据世界卫生组织的数据,全球有超过3亿人患病,每年因其死亡人数约为300万人,故及早发现和治疗至关重要〔8〕。而近年来随着中医治疗不断更新和发展,中医治疗慢阻肺在临床上也取得了良好效果成为当今医学领域的研究热点〔9〕。

本研究说明,余甘子叶提取物可显著改善慢阻肺大鼠气道高反应。富露施是临床上治疗慢阻肺等由浓稠黏液分泌物过多导致的呼吸道疾病的常用药物,其主要成分为N-乙酰半胱氨酸,其在化痰、抗氧化等方面发挥着重要作用,因此本文选其作为对照组〔10〕。余甘子叶是重要的传统民族药,已被载入多版《中国药典》,其主治感冒发热、咳嗽、咽喉痛、白喉、烦热口干、消化不良等症,且有研究表明,余甘子叶在体内外具有广泛的抗菌作用,故近年来广受中医药学者所关注〔11〕。气道高反应是气管、支气管的一种异常敏感状态,通常是由进入气道的一些物质或反应原刺激所引起,其极易引发各种呼吸系统并发症,从而导致气道阻塞 、肺功能急剧下降〔12〕。而包括慢阻肺在内的很多临床疾病都会表现出气道反应性增高,这使黏液不但大量产生和分泌,还较难被清除,从而导致气道狭窄,气流受限,进而引发肺实质破坏,加重期引起血管壁增厚,最终可能会引发肺心病、心力衰竭等疾病,因此有效改善气道高反应对提高患者生活质量具有深远意义〔13〕。对于慢阻肺大鼠,余甘子叶提取物可能是通过抑制支气管平滑肌收缩反应,来抑制支气管痉挛、气道分泌物增加,从而有效抑制炎症细胞从血管内释放、聚集,抑制气道重塑、抑制氧自由基的合成,进而抑制炎症反应、抑制氧化应激,达到改善气道损伤的目的,最终有效治疗疾病。陈安〔14〕研究显示,余甘子合剂对慢阻肺急性加重期患者具有显著疗效,可明显改善其临床症状体征、肺功能及氧化应激,这与本文结果类似。

本研究发现,余甘子叶提取物可以有效改善慢阻肺大鼠的肺损伤状况。研究发现,慢阻肺与肺部损伤密切相关,长期吸入烟草烟雾和其他有害气体和颗粒物会引起气道和肺组织的损伤和炎症反应,这些损伤和炎症会导致气道壁增厚、气道黏液分泌增多、气道平滑肌收缩、肺组织纤维化等,最终导致气道狭窄和气体交换障碍,因此如何抑制炎症反应,改善肺损伤情况在治疗慢阻肺方面尤为重要〔15〕。而当肺受到损伤时,肺部炎症可以使肺组织中的毛细血管壁变得通透性增加,使液体从血液中渗出到肺泡和间质空间,导致肺水含量的增加,肺水含量的增加会导致肺部功能的损害和呼吸困难,故及时识别和处理肺水积聚是重要的管理措施之一〔16〕。对于慢阻肺大鼠,余甘子叶提取物可能是通过抑制相关炎症因子及信号通路,来抑制应激的产生,从而抑制炎症渗出、减少损伤、并降低微血管通透性,进而使液体平衡恢复、减轻炎细胞浸润现象,最终达到改善疾病的目的。王文迪等〔17〕研究显示,对于烟雾吸入所致急性肺损伤大鼠,N-乙酰半胱氨酸具有显著疗效,可有效减轻其肺损伤,并减轻大鼠肺水肿及炎症反应,这与本文结果类似。

本研究说明,余甘子叶提取物可有效改善慢阻肺大鼠肺泡上皮细胞活性,抑制Caspase3表达。研究发现,肺泡上皮细胞和肺损伤与之间存在着重要的关系,其活性的改变是肺损伤发生、发展的主要因素〔18〕。凋亡是一种正常的细胞死亡过程,通过这种方式细胞可以主动地从组织中被清除,而不会引起炎症反应,但在肺损伤或疾病发生时,肺泡上皮细胞凋亡可能会增加,凋亡的调节失衡可能导致细胞死亡和炎症反应的进一步加重,从而使慢阻肺症状加重,故其变化是反映肺泡上皮细胞活性的有效指标〔19〕。Caspase3参与调控和执行细胞凋亡程序,其激活后可进一步激活其他Caspase酶,形成一个级联的酶活动网络,最终导致细胞的凋亡,故Caspase3的活性调节对于维持正常的细胞生存和细胞凋亡的平衡至关重要〔20〕。而对于慢阻肺大鼠,余甘子叶提取物可能是通过抑制其上游信号通路的激活,来抑制Caspase3的转录及翻译,从而抑制半胱氨酸蛋白酶类的级联激活、抑制炎性细胞聚集与活化,进而抑制神经氨酸酶、细胞色素c、促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2相互作用细胞凋亡促进因子(Bak)等的相互作用、抑制细胞凋亡等相关因子的产生,最终达到抑制细胞凋亡,有效改善疾病的目的。赵朝华等〔21〕研究发现,Caspase3在慢阻肺中表达显著上升,给予阿奇霉素治疗后,可改善大鼠肺组织形态和纤维化并抑制其氧化应激及Caspase3表达,这与本文结果类似。

综上,余甘子叶提取物可有效改善慢阻肺大鼠气道高反应及肺泡上皮细活性,其作用机制可能与抑制Caspase3表达有关。