基于NF-κB信号通路探讨被动运动对膝关节骨关节炎大鼠关节软骨的保护作用

董海亮 王文彪, 陆永莉 李辉 刘静文 王沐荣

(1 新乡医学院,河南 新乡 453000; 2新乡医学院第一附属医院)

膝关节骨关节炎(KOA)是目前临床上最普遍的慢性退行性关节疾病,关节软骨侵蚀、滑膜炎及软骨下骨重塑被认为是 KOA 发展的主要特征〔1～4〕。目前已知KOA是一个由炎症和代谢因素组成的复杂的过程。抑制关节炎症及软骨细胞外基质的降解是治疗的关键〔5,6〕。而核转录因子(NF)-κB长期以来被认为是一种炎症促成通路,在调控骨关节炎发生发展过程及软骨代谢平衡方面起重要作用,已成为KOA 的治疗靶点〔7〕。临床上KOA治疗指南一致推荐基于运动的疗法,包括物理疗法(PT),作为其有效性证据的核心组成部分〔8～11〕,其中被动运动因其实施简单方便,效果可靠,无创无痛,受到医患双方的欢迎。然而关于被动运动的动物实验研究甚少,其作用机制也不甚了解。因此,本研究拟观察被动运动对KOA大鼠膝关节的保护作用,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只成年健康雄性SD大鼠,平均体质量(260±10)g,购于山东省实验动物中心,实验动物使用许可证编号〔scxk(鲁)2020-0005〕,在使用前,所有动物都在(22±0.5)℃和 55%±5% 湿度的受控室中饲养至少1 w。 实验方案努力减少实验中使用的动物数量,并获得新乡医学院动物实验伦理委员会的批准,所有实验于新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心进行。

1.2造模 按随机数字表法抽取10只作为空白对照组,其余大鼠给予10%水合氯醛(0.34 ml/100 g)腹腔麻醉,用改良Hulth法诱导KOA模型〔12〕,右后肢用电动剃须刀剃毛,用75%医用酒精清洗。沿着膝关节的内侧边缘垂直切开髌骨周围的皮肤,暴露关节囊并打开,髌骨外侧移位并屈曲膝关节以暴露前交叉韧带。随后,用手术剪刀剪断前交叉韧带及内侧副韧带,摘除内侧半月板而不损伤胫骨软骨。用生理盐水反复冲洗关节腔,彻底止血,之后滴入少量青霉素溶液预防感染,然后将髌骨复位,缝合关节囊,逐层缝合浅筋膜和皮肤。手术造模后大鼠笼内自由活动。

1.3动物分组及干预 造模的20只大鼠标号后根据随机数字表分为两组。模型组术后笼内自由活动不做任何干预;被动运动组在造模术后第7天即开始进行被动运动,戴防抓咬手套,一手抓住大鼠身体,头尾露出,另一手抓住右后肢足趾向后牵拉,至大鼠右后肢完全伸直,然后再将后肢推向身体,使髋、膝、踝关节完全屈曲,每次活动5 min,2次/d活动,注意活动过程轻柔,速度适中,连续4 w;在实验方案结束后,大鼠通过脱颈方式处死。处死后取膝关节股骨髁部固定于4%中性甲醛中,取胫骨平台关节软骨置于-80 ℃冰箱保存,用于进行免疫组织化学评价和关节软骨组织形态学分析及Western印迹及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等分析。

1.4关节软骨组织形态学观察 取出的膝关节标本立即固定于4%中性甲醛中,固定48 h之后,浸泡于10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液中4 w,脱钙后进行石蜡包埋,切片,行苏木素-伊红(HE)染色、番红-O-固绿染色及甲苯胺蓝染色。镜下观察并进行Mankin评分〔13〕。

1.5免疫组织化学(IHC)分析 将膝关节软骨切片先进行烤片,之后在二甲苯中脱蜡,通过梯度乙醇水化并在0.3% H2O2/甲醇中孵育30 min以淬灭内源性过氧化物酶活性,之后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗 20 min。然后将切片使用微波炉加热暴露抗原活性,10%牛血清白蛋白封闭1 h,加白细胞介素(IL)-1β、基质金属蛋白酶(MMP)-13一抗4 ℃孵育过夜。次日室温下二抗孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色液显色后立即终止反应,用苏木素复染,封片后光镜下观察染色情况,并用ImageJ软件进行定量分析。

1.6RT-PCR分析 采用Trizol法提取软骨组织总RNA,测RNA浓度,OD值260/280在1.8～2.0之间可用于下一步实验。根据PrimeScript RT试剂盒的说明,将RNA逆转录成cDNA。再进行聚合酶链式反应(PCR)。设置好变性-退火-延伸反应条件,经40个循环。Gapdh作为内参,mRNA相对转录水平采用CT值法(2-△△Ct)计算。NF-κB抑制蛋白(IκB)上游：5′-AGAAATCTGGGAGCCCTGTG-3′,下游5′-ATGGCTGCCTAAATGCTCCA-3′;P65上游 5′-GAAGCACAGATACCACCAA-3′,下游5′-CAGCCTCATAGTAGCCATC-3′;IL-1β上游 5′-TGACCTCCACAGTTGACA-3′,下游 5′-CAGGCACTCCACATCTTG-3′;GAPDH上游 5′-GGTTTGCCGAGTAGACCTCA-3′;下游 5′-TGTAGCCGTATTCATTGTCA-3′。

1.7Western印迹法 提取软骨组织总蛋白：将软骨组织块置于研钵内,加液氮,研磨成粉状,加入蛋白裂解液放射免疫法缓冲液(RIPA)∶苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1。冰上裂解30 min。离心机设置12 000 r/min,4 ℃下离心30 min,将上清液分装入新的EP管,得到组织总蛋白。经二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测蛋白浓度,计算上样量。经5%浓缩胶和10%分离胶电泳后,恒压100 V转膜1.5 h,转膜后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,之后用1×TBST洗膜3次,每次10 min,洗膜后加一抗4 ℃摇床过夜。次日回收一抗,1×TBST洗膜10 min×3次,之后加二抗室温孵育2 h。洗膜后加发光液将条带曝光。所得条带定量分析用ImageJ软件进行。所有实验至少重复3次。

1.8统计学处理 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析,组间比较用Dunnett-t检验。

2 结 果

2.1关节软骨组织形态学 空白对照组关节表面光滑,软骨层厚,软骨细胞形态正常,排列整齐,软骨基质染色明显,潮线完整;模型组关节软骨表面不规则,血管翳形成,软骨细胞数减少,空泡明显,基质染色较浅,潮线被血管破坏;被动运动组关节软骨厚度增加,软骨基质染色较模型组加深,软骨细胞弥漫性增加,潮线较完整。与空白对照组比较,模型组和被动运动组Mankin评分显著升高(P<0.01);与模型组比较,被动运动组Mankin评分明显降低(P<0.05)。见表1、图1。

图1 各组软骨组织形态学

表1 各组关节软骨Mankin评分、软骨中MMP-13、IL-1β阳性细胞面积百分比、IL-1β、NF-κB P65、IκB基因mRNA比较

2.2免疫组织化学结果 免疫阳性细胞均被染成棕褐色。观察到各组标本中MMP-13和IL-1β的免疫阳性细胞,空白对照组免疫标记最少,模型组软骨中棕褐色着色明显,被动运动组介于两者之间。经ImageJ软件计算阳性细胞面积百分比,与空白对照组相比,模型组和被动运动组MMP-13、IL-1β阳性细胞面积百分比明显升高(P<0.05,P<0.01);被动运动组与模型组相比,阳性细胞面积百分比明显减少(P<0.05)。见表1、图2。

图2 各组软骨细胞中MMP-13、IL-1β表达(免疫组化染色,×400)

2.3各组IL-1β、NF-κB p65、IκB mRNA及蛋白表达 与空白对照组相比,模型组与被动运动组关节软骨中NF-κB p65、IL-1β的 mRNA及蛋白表达水平明显上调,IκB mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.01)。被动运动组相比于模型组,NF-κB p65、 IL-1β mRNA蛋白表达量及均下降,IκB mRNA及蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1、图3。

图3 各组关节软骨中IL-1β、NF-κB p65、IκB蛋白表达

3 讨 论

KOA主要病理特征为软骨退变、滑膜炎症、骨赘形成及软骨下骨改变等〔14～16〕。膝关节软骨主要由软骨细胞及细胞外基质构成,软骨细胞分泌合成基质,自身则位于细胞外基质陷窝内。细胞外基质的合成与降解失衡是导致软骨退变的重要原因之一,软骨基质的降解和细胞炎性因子的产生对KOA的病理进展至关重要〔1,17,18〕。MMP-13是靶向软骨降解的主要酶,与其他 MMP 相比,MMP-13在骨关节炎关节软骨和Ⅱ型胶原蛋白降解中发挥着至关重要的作用〔19～21〕。IL-1β可以独立地诱导炎症反应和软骨分解,也可以和其他介质一同发挥致炎作用〔22〕。NF-κB涉及免疫、应激反应、炎症性疾病、细胞增殖和细胞死亡。据报道,在大部分哺乳动物中,NF-κB 由 Rel 家族的5个成员组成的同源二聚体和异源二聚体组成,包括 NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(p65)、RelB 和 c-Rel,在这些二聚体中,最常见的是由RelA(p65)和p50组成的异源二聚体,几乎存在于所有哺乳动物细胞中〔7〕。NF-κB正常情况下存在与细胞质中并与IκBα结合,处于无活性状态,但受到刺激后NF-κB被释放并从细胞质转移到细胞核,随后促进炎症基因如MMP、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧化酶(COX)2和IL-1β的表达。所以NF-κB信号通路是KOA病情进展的重要的炎症相关通路〔23～27〕。

KOA治疗指南始终推荐基于运动的疗法,临床上被动运动适用于各种原因引起的膝关节骨关节炎,可拉伸肌肉及关节周围韧带,缓解肌肉痉挛、防止肌肉萎缩,恢复受损的关节周围和关节内结缔组织,能在提高KOA患者关节活动度的同时,减轻疼痛并改善膝关节功能〔28～30〕。本实验结果提示,被动运动可以抑制软骨细胞炎症及延缓软骨降解退变,显著抑制NF-κB信号通路的激活。

综上所述,被动运动能够抑制KOA大鼠关节软骨炎症、改善软骨基质降解,是一种简单易行、成本低廉且行之有效的治疗KOA的方法。本实验只是从NF-κB单一信号通路研究了被动运动可能作用的靶点,选择性地对关节软骨中IL-1β、MMP-13进行了研究,而KOA是由多条信号通路介导的多靶点影响的疾病,所以被动运动是否会影响其他信号通路和靶点,有待进一步研究。