糖尿病足严重程度连续分级创面菌群组成

蔡玉兰 阳琰 岳瑜 牟芝群 姚杨 胡皓铭 吴旻 邓嘉杰

(遵义医科大学附属医院内分泌与代谢病科,贵州 遵义 563003)

糖尿病足(DF)是糖尿病患者常见的严重并发症之一,指由于患者下肢不同程度神经和血管病变导致的足部溃疡、感染和(或)深层组织破坏,DF发病率及相关死亡率逐年升高,我国DF发病率高达15%,年截肢率高达22%,年死亡率高达11%〔1,2〕。准确识别DF创面中菌群组成,及时使用针对性的抗生素治疗,是创面愈合过程中最重要、最关键的一步。目前经验性抗生素的选用基于临床医生对DF创面严重程度的判断和指南中对广谱抗生素的推荐,结合患者对当前抗生素的治疗效果,综合决定抗感染治疗方案〔3〕。然而,DF中多重耐药菌的高发生率与广谱抗生素的不恰当使用密切相关〔4〕。越来越多的证据表明,基于下一代测序的菌群分析具有全面、快速的优势,可以为DF的诊治提供可靠依据。目前尚未有研究基于下一代测序全面分析DF创面菌群组成,本文基于16S rRNA测序分析不同严重程度DF创面菌群的组成。

1 对象与方法

1.1研究对象 纳入2020年7月至2021年7月遵义医科大学附属医院治疗的DF患者80例,根据患者创面感染严重程度、体征及检验指标将患者分为足部血流、受影响范围、严重程度、感染、感觉能力(PEDIS)1、2、3、4级组,每组20例。各组性别组成、年龄、体质量指数、空腹血糖、血红蛋白及白蛋白等资料无明显差异(P>0.05)。随着患者的DF病程增加,其PEDIS分级也逐渐增加。且PEDIS分级越高的DF患者,血糖控制不佳,糖化血红蛋白逐渐增加有统计学差异(P<0.05)。血白细胞、血中性粒细胞、降钙素原、C-反应蛋白、红细胞沉降率及血肌酐均随着PEDIS分级的增加而逐渐升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组人口统计学和实验室资料(n=20)

1.2纳入与排除标准 纳入标准：①符合2019 国际糖尿病足工作组指南中对糖尿病足的诊断并符合PEDIS分级。PEDIS 1级(未感染)：创面无炎症表现或脓性分泌物;2级(轻度感染)：局部感染,仅累及皮肤和皮下组织,未累及深层组织,溃疡周围皮肤炎症范围≤2 cm2;3级：具备轻度感染的表现,同时感染累及皮肤和皮下深层组织(如：肌腱、肌肉、关节和骨),溃疡周围皮肤炎症范围>2 cm2,不存在感染的全身中毒表现;4级(重度感染)：具备中度感染的表现,并有全身炎症反应综合征(SIRS)≥2项的以下表现：体温>38 ℃或<36 ℃;心率>90次/min;呼吸频率>20次/min或动脉二氧化碳分压<32 mmHg;白细胞计数>2×109/L或<4×109/L,或不成熟形式≥10%〔5,6〕;②未合并其他皮肤病变;③未合并其他可能影响创面愈合的疾病：如自身免疫性疾病等;④患者及其家属同意参与本项研究。排除标准：①合并严重心、脑、肾疾病;②虽存在足部病变,但未明确诊断糖尿病;③既往有服用免疫抑制剂或激素等影响自身免疫及创面愈合的药物。

1.3取样 取适量生理盐水冲洗创面,清除创面表面坏死组织后取深部组织标本,立即保存于-80 ℃,用于后续样本DNA的提取。标本命名为DF01、DF02……DF80,其中,DF01～20为PEDIS 1级组,DF21～40为PEDIS 2级组,DF41～60为PEDIS 3级组,DF61～80为PEDIS 4级组。

1.416S rRNA测序 根据组织DNA提取试剂盒的操作步骤(EchoLUTION),在同一时间提取保存在-80 ℃创面组织的DNA,经过质控后PCR扩增细菌16S rRNA基因的V3、V4区(引物序列：V3区：355F：5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′和534R：5′-ATTACGGCGGCTGCTGG-3′;V4区：515F：5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′和806R：5′-GGACTACNVGGGTWTCTAA-3′)。扩增后的产物经过质量检测及纯化后构建测序文库,上机测序(测序平台为：Illumina;测序方案为：PE250)。

1.5下机数据处理 测序获得的下机数据经过拆分、组合、质控、聚类后与Greengenes数据库比对进行物种注释。

1.6统计学方法 采用SPSS23.0软件进行统计分析,符合正态分布的计量资料、独立样品t检验、独立样品曼-惠特尼U检验、Pearsonχ2检验。

2 结 果

2.1菌群α多样性分析 反映菌群物种丰富度的Chao1(P=0.518)和ACE指数(P=0.621)在PEDIS 1～4级中无显著差异,而反映物种多样性的Shannon和Simpson指数在4组中有明显差异,呈逐渐降低趋势(均P<0.001),见图1。

图1 菌群的α多样性分析

2.2优势菌门及优势菌属分析 随着DF患者PEDIS分级的增加,创面菌群中厚壁菌门及放线菌门的丰度逐渐降低,而拟杆菌门的丰度逐渐增加,在PEDIS 4级创面中丰度最高。随着PEDIS分级的增加,创面中普氏菌属、厌氧球菌属、拟杆菌属、戈尔德菌属的丰度逐渐增加,链球菌属、葡萄球菌属的丰度逐渐降低(P<0.05),见图2。

图2 各组优势菌门、菌属堆叠图

2.3各组Marker菌群分析 基于LEfSe分析寻找各组Marker菌群,结果显示,PEDIS 1～4级组的Marker菌门分别是厚壁菌门、厚壁菌门、变形菌门及拟杆菌门;PEDIS 1～4级组的Marker菌属分别是链球菌属、厌氧球菌属/葡萄球菌属、克雷伯菌属及普氏菌属(P<0.05),见图3。

图3 各组Marker菌门及菌属分析

3 讨 论

近年来,糖尿病患病率逐年升高,2015～2017年我国第8次全国性糖尿病流行病学调查结果显示,我国糖尿病患病率已高达11.2%,中国内地的糖尿病患者预计达1.298亿(2020年中国2型糖尿病防治指南)〔7〕。糖尿病患病人数逐年升高,多种糖尿病相关并发症的发生率也随之上升,其中,对患者生活质量影响最大的DF的患病率显著上升。2016年,糖尿病相关下肢并发症的患者人数达到全球人口总数的1.8%(1.31亿),DF不仅是常见需要住院治疗的糖尿病并发症,也是糖尿病患者下肢截肢的最常见诱因,高达28%的DF患者发生不同程度的下肢截肢,全世界约每20 s就有1例患者因为DF失去下肢。据统计,因DF进行大截肢或小截肢的患者,术后5年死亡率接近40%〔8〕。DF发病率高、预后差,不仅降低了患者的生活质量,还带来了巨大的经济负担,对医疗保健体系挑战巨大〔9〕。

感染是导致DF创面加重,影响其创面愈合的重要因素,目前的治疗通常基于临床医生对患者创面严重程度的判断而经验性选用抗生素。基于培养法的研究结果提示,DF创面中最常见的革兰阳性(G+)球菌是金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、无乳链球菌;最常见的革兰阴性(G-)杆菌是大肠埃希菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌〔10〕。基于Wagner分级的DF创面菌群培养结果显示,Wagner 2级创面中金黄色葡萄球菌占52.63%,大肠埃希菌占25.00%。Wagner 3级创面中金黄色葡萄球菌占82.61%,大肠埃希菌占30.00%。Wagner 4级创面中金黄色葡萄球菌占66.67%,大肠埃希菌占25.00%〔11〕。随着DF创面进展,PEDIS分级增加,创面中G+菌的丰度逐渐降低,G-菌的丰度逐渐增加,且好氧菌逐渐转变为厌氧菌。可以看出,培养法虽然仍然是在临床上占主导地位的微生物检测方法,但受限于培养条件及取样方法等,其在培养厌氧菌方面的有效性仍具有争议〔12〕。且随着DF进展,创面越来越深,感染厌氧菌的可能性会大比例升高,浅层好氧菌消耗掉氧气也给深层的厌氧菌生长创造了条件〔13〕。与本研究获得的结果相符,最常见的厌氧菌是普氏菌属及厌氧球菌属。

本研究利用16S rRNA测序全面分析了DF创面进展过程中的创面菌群组成,更全面地阐述了不同PEDIS分级创面中的菌群差异。但目前高通量测序技术分析感染组织标本中菌群组成的方法还未纳入临床常规操作流程,尚不能直接指导临床治疗。此外,涉及DF创面菌群毒力因子和抗生素抗性及创面菌群之间相互作用的研究还有待完善。随着研究的深入,高通量测序技术将来在临床上的应用会越来越多,有望替代传统培养法成为临床一线检测方法。