分离自北京口岸进出口食品的大肠埃希氏菌耐药性筛查分析

赵晓娟 刘婧洋 魏咏新 张西萌 马丹 魏海燕*

（1.中国海关科学技术研究中心 北京 100026；2.首都医科大学燕京医学院）

0 引言

近年来，食品中致病菌的抗生素耐药性问题引起全球广泛关注。陈君石院士指出“食品中致病菌的高耐药性和多重耐药性必须引起足够警惕，因为这可能是人体产生多重耐药性的一种重要途径”。2017 年，世界卫生组织公布了首份亟需新型抗生素治疗的重点病原体清单，其中大肠埃希菌排名第三位[1]。根据最新发布的全国耐药监测报告，大肠埃希氏菌在分离的革兰氏阴性菌中占据首位。食物链是耐药菌的重要传播途经，监测食品中大肠埃希菌的耐药性迫在眉睫。食品生产加工过程中的药物使用情况，以及市售抗生素的监管严格程度[2]，均会对大肠埃希菌的耐药性产生影响。

常规药敏试验方法包括扩散法、稀释法、E-test法，但这些均存在培养时间长、结果判断易受影响等问题，本实验采用Sensititre 快速药敏检测系统，基于微量肉汤稀释法原理，利用荧光技术测定菌株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）值进行研究。近年来，已有从家禽家畜中分离出大量产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrum β-Lactamase，ESBLs）大肠埃希菌的报道[3]。产ESBLs 的菌株不仅对青霉素和头孢菌素表现出耐药性，而且对各种抗生素表现出多重耐药性。现有对大肠埃希菌的耐药报道主要源于临床和国内食品分离菌株，为了解进出口食品中大肠埃希氏菌的耐药情况，现针对本实验室近年从北京口岸进出口禽畜类动物食品中分离的111 株大肠埃希氏菌进行耐药性分析，以期为监管部门制定相关政策及评估干预措施的有效性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

分离自家禽类、家畜类食品中的大肠埃希菌111 株，均为中国海关科学技术研究中心食品安全研究所保存。其中，家禽来源51 株、家畜来源60 株；进口食品来源42 株，出口食品来源69 株。

Sensititre 肉汤培养基（美国赛默飞公司）；Sensititre去离子水（美国赛默飞公司）；0.5 McFarland 聚合物浊度标准品（美国赛默飞公司）；脑心浸液琼脂培养基（BHI，北京陆桥科技股份有限公司）；食源性监测定制药敏板CHNM4F、CHN2FGNF、CHN1VGNF（美国赛默飞公司）。

1.2 仪器与设备

THZ-C-1 全温振荡器（太仓市实验设备厂）；430-A AIM 全自动加样仪（96 孔板接种仪，美国赛默飞公司）；Nephelometer 麦氏比浊仪（美国赛默飞公司）；Sensititre OptiRead 微生物鉴定和药敏分析仪（美国赛默飞公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

将储存于-80℃冰箱的菌株以平板划线法接种于BHI 平板，36℃培养24 h。活化2 代。

1.3.2 肉汤菌悬液制备

挑取3～4 个单菌落于生理盐水中，用Thermo scientific Nephelometer 麦氏比浊仪调至0.5 麦氏比浊度，取10 μL 菌悬液于肉汤培养基中混匀备用。

1.3.3 药敏板制备

应用Thermo scientific 430-A AIM 全自动加样仪（96 孔板接种仪），将加入菌悬液的肉汤培养基置于药敏板中，每孔50 μL，覆膜，35℃培养24 h。

1.3.4 药敏结果读取

应用Thermo scientific OptiRead 药敏分析系统以及Sensititre SWIN 药敏分析软件，对大肠埃希氏菌进行药物敏感性分析，选取33 种药物进行测试，具体用药种类见图1。

图1 北京口岸分离的大肠埃希菌耐药百分比Fig.1 Percentage of drug-resistant Escherichia coli isolated at Beijing port

质控方法及结果判定：按照上述大肠埃希氏菌药敏实验操作方法，使用标准菌株大肠埃希菌ATC C25922 进行质控试验，再根据Thermo scientific OptiRead 药敏鉴定技术以及Sensititre SWIN 药敏分析软件系统，判定质控菌株的MIC 结果是否符合标准菌株的范围，确定结果符合范围后，方可认定所检测的大肠埃希氏菌对抗生素的耐药性准确有效。

1.3.5 ESBLs 确认实验

采用纸片扩散法同时对头孢噻肟30 μg、头孢噻肟/克拉维酸30/10 μg、头孢他啶30 μg、头孢他啶/克拉维酸30/10 μg 进行药物敏感性测试，在任一头孢他啶、头孢噻肟中添加克拉维酸后，将其抑菌圈直径与未添加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5 mm时，即可判定为ESBLs。

质控方法及结果判定：按照上述ESBLs 判定实验操作方法，使用菌株大肠埃希菌ATCC25922 进行质控试验，所测试药物联合克拉维酸后的抑菌圈直径与单药抑菌圈相比，增大值≤2 mm。

1.3.6 统计学分析

使用SPSS 26.0 统计软件进行数据处理，采用卡方检验和fisher 精确法分析检测结果的差异性。

2 结果与分析

2.1 耐药表型分析

采用微量肉汤稀释法对111 株北京口岸分离的食源性大肠埃希菌进行耐药表型分析，结果显示，88株大肠埃希菌有耐药性，耐药率为79.3%；对头孢氨苄耐药率最高，耐药率为62.2%；四环素、萘啶酸、复方新诺明耐药率在25%～35%之间；未检出厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、替加环素、头孢他啶/阿维巴坦、呋喃妥因耐药（见图1）。

2.2 家禽、家畜来源大肠埃希菌的耐药率比较

家禽和家畜来源的大肠埃希菌对头孢氨苄的耐药率均为最高（59.4%、73%），家畜源性大肠埃希氏菌对四环素耐药率高达67.6%，对复方新诺明、萘啶酸、氨苄西林等药物的耐药率均在40%以上，对氯霉素、氟苯尼考、庆大霉素的耐药率在20%～35%之间，而家禽源性大肠埃希氏菌除头孢氨苄外，其余药物的耐药率均在40%以下，对萘啶酸耐药率约为37.5%，对四环素、氨苄西林、复方新诺明、环丙沙星等药物的耐药率保持在28%左右，此外，两类不同来源大肠埃希氏菌对头孢菌素类、多黏菌素类均较为敏感（多数耐药率在10%左右及以下），未检测到厄他培南、美罗培南、亚胺培南耐药。在所有药物中，家畜源性大肠埃希氏菌对有11 种药物的耐药率高于家禽源，其中复方新诺明、氯霉素、多西环素统计学差异显著（P＜0.05），四环素差异极显著（P＜0.01）；而家禽源性大肠埃希氏菌对其余15 种药物的抗药性均大于家畜源，但尚未发现统计学差异（见表2）。

表2 家禽、家畜来源大肠埃希菌耐药率比较[株（%）]Table 2 Comparison of antibiotic resistance rates of Escherichia coli from poultry and livestock sources[strains（%）]

2.3 进口食品与出口食品中大肠埃希菌的耐药率比较

在111 株食品分离的大肠埃希菌中，有69 株源自出口食品，42 株源自进口食品。69 株境内食品中分离的大肠埃希菌对头孢氨苄耐药率最高，达66.7%，对四环素、萘啶酸、复方新诺明、氨苄西林耐药率在40%左右，而对米诺环素、头孢西丁、头孢类药物（除头孢氨苄外）表现较为敏感，耐药率在10%及以下，未检出厄他培南、亚胺培南、替加环素、阿米卡星、头孢他啶/阿维巴坦等药物的耐药。在42 株进口食品中分离的大肠埃希菌中，发现有抗药性的大肠埃希菌菌株较少，在进口食品中分离的大肠埃希菌对头孢氨苄的耐药率为54.8%、四环素的耐药率为16.67%、萘啶酸耐药率为14.29%，其余均低于10%。除米诺环素外，国内源大肠埃希菌对某一抗生素的耐药率高于国外源大肠埃希菌，对氨苄西林、复方新诺明、环丙沙星、萘啶酸、四环素、氯霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、氧氟沙星的耐药率差异较大，且发现统计学意义（见表3）。

表3 进口、出口食品中大肠埃希菌耐药率比较[株（%）]Table 3 Comparison of resistance rates of Escherichia coli in imported and exported foods [strains（%）]

2.4 多重耐药结果

111 株北京口岸食品中分离的大肠埃希菌中有38 株表现为多重耐药性（34.2%）（见图2），其中耐3～5 种药物的大肠埃希菌有12 株，耐6～8 种药物的大肠埃希菌有7 株，耐10～13 种药物的大肠埃希菌有6 株，耐16～24 种药物的有5 株，耐9 种药物的大肠埃希菌最多，共有8 株，占多重耐药菌株的22.2%，未检测到耐全部药物的大肠埃希菌。有23 株大肠埃希菌对全部药物敏感，有9 株来自国内（13%，9/69），14 株来自国外（33.3%，14/42），12 株分离自家禽（23.5%，12/51），11 株分离自家畜（18.3%，11/60）。从禽畜来源角度分析，家禽源性大肠埃希菌中多重耐药菌株占比25.5%，家畜类大肠埃希菌中多重耐药菌株占比41.7%，多重耐药在家禽家畜之间尚未发现有统计学意义。从进出口食品来源角度看，在42 株进口源大肠埃希菌中，仅发现4 株多重耐药菌，占9.5%，而国内源多重耐药大肠埃希菌中发现多重耐药菌株为34 株，占49.2%，以耐9 种药物的菌株较多，且进出口之间发现统计学差异（P＜0.01）。

图2 北京口岸分离大肠埃希菌多重耐药分布情况Fig.2 Distribution of multidrug-resistant Escherichia coli isolated at Beijing Port

2.5 食源性大肠埃希菌ESBLs 检测结果及耐药率比较

经ESBLs 确证实验发现，在111 株大肠埃希菌中ESBLs 检出率为8.2%。9 株ESBLs 中的药敏表型结果显示，产ESBLs 大肠埃希菌对氨苄西林、头孢唑林、头孢噻肟等耐药率为100%，对头孢噻呋、西环素以及复方新诺明也保持着较高的耐药率。除氯霉素外，产ESBLs 的大肠埃希菌对比其他26 种药物的耐药率均要高于非产ESBLs 大肠埃希菌（见表4）。头孢西丁、头孢氨苄、氟苯尼考、米诺环素、萘啶酸5 种药物差异显著（P＜0.05）外，其余20 种药物差异极显著（P＜0.01）。在9 株确认的大肠埃希菌中，有8 株来自于国内，家禽家畜来源各4 株，1 株来自于进境食品，为家畜源。非产ESBLs 大肠埃希多以耐1 种药物为主（40.6%），而产ESBLs 的大肠埃希菌均发生了多重耐药，其中多以耐13 种抗生素为主（33.3%）（见图3），产ESBLs 大肠埃希菌分离株对3 种以下抗生素的耐药明显低于非产ESBLs 大肠埃希菌（P＜0.01），但对3 种以上的抗生素耐药显著高于非产ESBLs大肠埃希菌（P＜0.01），由此可见产ESBLs 大肠埃希菌不仅有较高的耐药率且多重耐药情况严重。

表4 产与非产ESBLs 大肠埃希菌耐药率的比较（株）Table 4 Comparison of antibiotic resistance rates between ESBLs producing and non ESBLs producing Escherichia coli（strains）

图3 产/非产ESBLs 多重耐药比较Fig.3 Comparison of multiple drug resistance between ESBLs produced and non produced

3 讨论与结论

此次从北京口岸出口食品中分离的69 株大肠埃希菌，耐药株约占87%，对四环素、萘啶酸、复方新诺明、氨苄西林等耐药率较高，约为40%～45%。与国内其他地区分离菌株相比[4-6]，此次从北京口岸出口食品中分离的大肠埃希氏菌耐药率普遍偏低，耐药谱基本一致，只是排名稍有差异，这可能与食品质量把控的严格程度有关。而在进口的42 株食品中分离的大肠埃希菌中，发现28 株为耐药株（66.7%），主要是对四环素、萘啶酸耐药，但耐药率相对偏低，约为15%。据文献报道，在亚洲、北美洲、大洋洲、非洲等地区的食品中分离出的大肠埃希菌对β-内酰胺酶类、四环素类、磺胺类等药物的耐药率也处于较高水平[7-9]，如从西澳州[14]零售鸡蛋中分离的大肠埃希氏菌对四环素和氨苄西林的耐药率高达49%；从韩国[10]2019 株禽类食品中分离出的大肠埃希菌对萘啶酸、氨苄西林和四环素的耐药率均高于60%。北京口岸进口食品分离的菌株耐药率较低，推断原因如下：我国肉类食品进口国主要为巴西、美国、俄罗斯等，其原料筛选、生产加工及运输等各环节都具备较完善的监管体系；欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）发布的最新抗微生物药物消费和耐药性分析报告显示，氨苄西林、喹诺酮类等药物在可食用动物中的使用有所减少且低于人类[11]，所以进口食品来源的大肠埃希菌的耐药率相较于国内来源低。

食物链被认为是耐药菌从动植物传播到人体的重要途径，所以监测食品中的多重耐药菌株也十分重要。在111 株食品源大肠埃希菌中，至少对一种药物耐药的菌株约占79.3%（88/111），对每一种药物都敏感的菌株约占20.7%（23/111），多重耐药率约为34.2%，出口食品分离的大肠埃希菌多重耐药检出率（49.2%）要远高于进口食品来源的大肠埃希菌（9.5%）。国内各地区之间多重耐药率略有不同，这可能与地区经济卫生条件等有关，据王丽丽等[12]研究，发现2014—2018 年间北京市大肠埃希菌的多重耐药情况出现多重耐药菌株以及耐药谱种类逐年增多的趋势，从2014 年的38.9%上升至62.7%，且家畜类大肠埃希菌多重耐药率（42.1%）大于家禽类（33.3%），与本研究相一致。

ESBLs 是以灭活窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及抗革兰氏阴性杆菌青霉素等抗生素为特征的β-内酰胺酶。北京口岸进出口食品中发现ESBLs大肠埃希菌9 株，检出率为8.2%。虽然本次实验在进口菌株中仅发现1 株家畜类ESBLs 大肠埃希菌，但国外研究显示ESBLs 大肠埃希菌分离率并不低，如GRUEL 等[13]在法国禽畜肉类中发现在22%的家畜和35.3%的家禽中检测到ESBLs 大肠埃希菌菌株，除此以外，像越南[14]、南非[15]等国家ESBLs 大肠埃希菌检出率更是高达60%以上。本研究结果显示产ESBLs 大肠埃希菌较非产ESBLs 大肠埃希菌对某一种药物有更高的耐药率，且多重耐药情况严重，其中多以耐13 种抗生素为主（33.3%）。随着革兰氏阴性菌耐药性加剧导致第三代头孢菌素类或碳青霉烯类抗菌药物治疗失败增加，而绝大多数革兰阴性菌仍对多黏菌素敏感，使得多黏菌素成为治疗革兰阴性菌感染的关键药物[16]。依据2022 年最新发布的中国细菌耐药监测报告中大肠埃希菌对多粘菌素耐药率约为2.1%[17]，在北京口岸分离的111 株大肠埃希菌中发现3 株多黏菌素耐药菌株，耐药率为2.7%。

多年来，食源性疾病一直备受关注，已成为国家重点监测项目，其中大肠埃希菌的分离率逐年上升。食物链是耐药菌的重要传播途径，本研究掌握的北京口岸大肠埃希菌的耐药情况，可为制定疾病预防与宣传方案，科学保障食物在加工与食用环节的卫生，倡导畜牧业减少抗生素的大量使用，合理使用高效抑菌抗生素提供依据。