气相色谱-串联质谱法同时测定衢枳壳中多种农药残留

雷美康 彭芳 陈瑶 许源 余琪 邓徐霞 祝子铜*

（1.杭州海关技术中心 浙江杭州 310016；2.衢州海关综合技术服务中心；3.温州海关综合技术服务中心）

0 引言

衢枳壳是芸香科植物常山胡柚（citrus chang shan-huyou）的干燥未成熟果实，主产于浙江，2015版《浙江省中药炮制规范》修订后，将“常山胡柚片”收录其中，并正式命名为“衢枳壳”[1-4]。衢枳壳味苦、辛、酸，性微寒，归脾、胃经，有理气宽中、行滞消胀功效，可用于胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等症[5-6]。目前，衢枳壳年产万余吨，实现了胡柚“药食同源”“一果三用”的全产业资源化利用，当地种植户增收2 亿多元，“衢枳壳”也列入浙江省“新浙八味”中药材培育品种[7-9]。衢枳壳树为多年生植物，其生长的土壤、环境和气候等条件的影响在一定程度上增加了外源污染物残留的风险。

2019 年10 月，党中央国务院《关于促进中医药传承创新发展的意见》指出：分区域、分品种完善中药材农药残留、重金属限量标准，建立最严谨标准。衢枳壳虽然被收录于《浙江省中药炮制规范》和新“浙八味”中药材培育名单，但目前尚无衢枳壳中农药、真菌毒素和重金属的检验标准及防霉储藏方法，不利于生产经营行为的规范及产品质量的监管。近年来，随着气相色谱-串联质谱仪的推广应用，对中药材中数十种以上农药残留同时检测的技术成为研究热点[9-16]。

本文以气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）为检测手段，以分散固相萃取净化方法为基础，并在衢枳壳上200 余种不同农药分析中的适用性，对衢枳壳品质控制关键技术研究并推广应用，推动衢枳壳产业高质量发展，为建设健康产业提供重要支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

气相色谱-串联质谱仪（GCMS-TQ8040，日本岛津公司）；超纯水装置（Milli-Q Advantage A10，美国Millipore 公司）；漩涡混（MS 3 digital，德国IKA 公司）；氮吹仪（MD 200，杭州奥盛仪器公司）；超声波清洗仪（KQ-500B，昆山市超声仪器公司）；高速离心机（Multifuge X1R，美国Thermo Scientific 公司）；高速粉粹机（QE-200g，浙江屹立工贸有限公司）。

农药混合标准品：浓度为50 μg/mL（±3%，k=2），0～8℃避光保存，北京振翔科技有限公司；内标物质：环氧七氯，介质为甲醇，浓度为100 μg/mL（±3%，k=2），0～8℃避光保存，北京振翔科技有限公司；内吸磷-S（1 000 μg/mL，介质为丙酮）、氟甲腈（1 000 μg/mL，介质为丙酮）、o，p'-三氯杀螨醇（100 μg/mL，介质为丙酮）、氟虫腈砜（1 000 μg/mL，介质为丙酮）、苯线磷（1 000 μg/mL，介质为丙酮），上海安谱璀世标准技术服务有限公司；甲醇、乙酸乙酯：色谱纯，美国fisher公司；分散固相萃取净化管：无水硫酸镁1 200 mg，N-丙基乙二胺400 mg，十八烷基硅烷键合硅胶400 mg，石墨化碳黑200 mg，上海安谱实验科技股份有限公司；冰醋酸：优级纯，上海国药集团；无水硫酸镁、无水硫酸钠，上海安谱实验科技股份有限公司；试验样品：某衢枳壳生产加工企业提供，常温保存。

1.2 标准储备溶液配制

5 种农药混合标准品：单独农药标准储备溶液（1 000 mg/L）用乙腈逐级稀释至50 μg/mL。

内标溶液：内标储备溶液（100 μg/mL）用乙腈稀释至5 μg/mL 为内标溶液。

基质混合标准工作溶液：空白基质溶液氮气吹干，加入20 μL 内标溶液，加入1 mL 相应质量浓度的混合标准溶液复溶，过微孔滤膜。基质混合标准工作溶液应现用现配。

1.3 标准工作曲线

精确吸取一定量的混合标准溶液，逐级用乙酸乙酯释成质量浓度为0.005、0.01、0.05、0.10 和0.50 mg/L的标准工作溶液。空白基质溶液氮气吹干，加入20 μL内标溶液，分别加入1 mL 上述标准工作溶液复溶，过微孔滤膜配制成系列基质混合标准工作溶液，供气相色谱-串联质谱联用仪测定。以农药定量离子峰面积和内标物定量离子峰面积的比值为纵坐标，农药标准溶液质量浓度和内标物质量浓度的比值为横坐标，绘制标准曲线。

1.4 样品制备

取适量样品（约为容器的90%），置于粉粹机中1～2 min，粉末过三号筛，未过筛的大颗粒重新放入粉粹机再次粉碎。试样放入密封袋中，干燥保存。

1.5 样品前处理过程

称取3 g（精确至0.01 g）样品置于50 mL 离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min。精密加入乙腈10 mL，涡旋混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min。加入无水硫酸镁6 g 与无水乙酸钠1.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min，水浴冷却至常温，4 000 r/min 离心5 min，取上清液6 mL，置预先装有净化材料的分散固相萃取净化管（无水硫酸镁1 200 mg，N-丙基乙二胺400 mg，十八烷基硅烷键合硅胶400 mg，石墨化碳黑200 mg）中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min 使净化完全，4 000 r/min 离心5 min，精密吸取上清液2 mL，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至近干。离心管均加入20 μL 内标溶液（5 mg/L），再用乙腈稀释至1.0 mL，涡旋混匀，4 000 r/min 离心5 min，滤过，取续滤液，即得。

1.6 GC-MS/MS 条件

1.6.1 气相色谱条件

色谱柱：（5%苯基）甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm）。柱温箱升温程序：初始温度90℃，保持1 min，以30℃/min 的速率升至130℃，再以10℃/min 的速率升至300℃，保持10 min，总运行29.33 min。载气：高纯氦气（He）；恒线速度模式，线速度55.0 cm/sec；进样口温度：250℃；进样方式：高压不分流进样，进样量：1 μL。

1.6.2 质谱条件

离子源：电子轰击源（EI）；离子源温度：230℃；接口温度：290℃。溶剂延迟时间：2.41 min；采用多反应监测模式（MRM），每个农药选取2 个特征MRM反应，其中一个作为定量离子对，另一个作为定性离子对，具体见表1。

表1 质谱参数Table 1 MS parameters

1.7 实验步骤和定量方法

将基质混合标准工作溶液和试样溶液依次注入气相色谱-质谱联用仪中，保留时间和定性离子定性，测得定量离子峰面积，待测样液中农药的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。内标法进行定量。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

实验选取适用于多农残分离的（5%苯基）甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（Rtx-5MS，30 m×0.25 mm，0.25 μm），通过优化进样方式、载气流速、程序升温等测定条件，获得多种农残测定的气相色谱分离条件。

在全扫描模式下，确定224 种测定农药目标物和内标物的保留时间和主要母离子，然后对母离子进行碰撞解离，并扫描其碎片离子，得到母离子对应的碎片子离子；优化碰撞能量、碰撞气压等参数，选择丰度较强和干扰较少的离子对作为定量和定性离子对。优化后农药目标物和内标物质的质谱参数见表1。

2.2 基质效应评价

基质效应是痕量分析的常见现象。样品基质中的共提取干扰物影响待测化合物的仪器响应值，使得相同浓度的目标化合物在溶剂标准溶液与基质标准溶液的响应值不一致，表现为基质标准溶液的仪器响应发生增强或抑制。本文采用下式对目标化合物的基质效应进行评价：基质效应=（样品基质中农药的峰面积/纯溶剂中农药的峰面积）－1，大于或小于1 分别表示基质增强或基质抑制[17-18]。选取浓度水平为0.05 mg/kg 的200 种农药（剔除易分解农药）进行基质效应实验，结果表明，绿谷隆和去草净（特丁净）基质抑制，基质效应分别为0.82 和0.86；45 种农药的基质效应介于1～2 之间；153 种农药基质效应大于2，其中氟酰胺基质效应最强，为3.01。为克服基质效应的影响，采用基质匹配内标标准曲线法进行定量。

2.3 线性关系和方法定量限

按照“1.2”方法配制基质混合标准工作溶液，采用本方法进行前处理和测定。以各组分的质量浓度为横坐标，对应峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，进行回归分析。结果表明，224 种农药均在0.01～0.5 mg/L 范围内呈良好线性关系，相关系数（R）均大于0.99。由于待测农药数量多，难以逐一稀释至每个农药的最低检出浓度，因此在空白样品中添加回收实验，得到方法定量限（LOQ）为0.02～0.10 mg/kg。日常衢枳壳中多种农药残留快速筛查，可采用单个浓度点定量。

2.4 添加回收试验

将混合标准储备溶液添加到衢枳壳空白样品中，按“1.4”方法分别制得加标水平为0.02、0.05、0.10 mg/kg的样品溶液，每个水平重复6 次。其中，0.10mg/kg 加标水平下的平均回收率和相对标准偏差（RSD）：224种农药的回收率为53.06%～100.56%，RSD 在5.03%～16.79%；0.05 mg/kg 加标水平下的平均回收率和相对标准偏差（RSD）：除禾草敌、二溴磷、脱乙基阿特拉津（脱乙基莠去津）、阿特拉通、绿谷隆、艾氏剂、对硫磷、环唑醇-1（环丙唑醇-1）、氟环唑-1、氟环唑-2、氟氯氰菊酯-2、氟氯氰菊酯-3 等12 种农药外，其余212 种农药的回收率为50.56%～104.44%，RSD 在3.90%～19.17%；0.02 mg/kg 加标水平下的平均回收率和相对标准偏差（RSD）：除敌敌畏、禾草敌、异丙威、二溴磷、脱乙基阿特拉津（脱乙基莠去津）、阿特拉通、内吸磷-S、嘧霉胺、克百威、西玛津、绿谷隆、炔苯酰草胺、艾氏剂、嗪草酮、氟甲腈、甲基对硫磷、对硫磷、敌稗、甲拌磷亚砜、苯硫威、2，4'-滴滴滴、苯线磷、异狄氏剂、抑霉唑、虫螨磷-1、氟虫腈砜、苯草醚、环唑醇-1（环丙唑醇-1）、丙环唑-1、丙环唑-2、三唑磷、氟环唑-1、氟环唑-2、环嗪酮、三氯杀螨砜、氯菊酯-1、氟氯氰菊酯-2、氟氯氰菊酯-3、氟氯氰菊酯-4、溴氰菊酯-2、o，p-三氯杀螨醇等41 种农药外，其余183 种农药的回收率为34.72%～112.50%，RSD在6.27%～26.70%。

对各加标水平下224 种农药的回收率进行分析。结果显示，0.02 mg/kg 加标水平下有170 种农药的回收率为55%～120%，占农药总数的75.9%；0.05 mg/kg 加标水平下有211 种农药的回收率为55%～120%，占总数的94.2%；0.10 mg/kg 加标水平下有223种农药的回收率为55%～120%，占总数的99.6%。

3 结论

本文采用乙腈提取和分散固相萃取对样品进行提取与净化，建立了快速检测枳壳中224 种农药残留的气相色谱-串联质谱方法。本方法样品前处理简便、快速，灵敏度与准确度满足农药残留检测要求，可用于衢枳壳中农药多残留的快速测定，为衢枳壳农药的合理规范使用提供了技术参考。