超高效液相色谱-高分辨质谱法分析不同食品基质中多种新型合成大麻素

郭思言 蔡翔宇 郑文 景渝 何梦婷 程妮郦 李晓华郗存显 李光满 刘高峰 廖海霞

（1.重庆海关技术中心 重庆 400020；2.南宁海关技术中心；3.重庆海关；4.电子科技大学实验中学）

0 引言

大麻可作为药用植物使用，其主要活性成分是以四氢大麻酚（THC）为代表的包括大麻二酚（CBD）、大麻酚（CBN）等在内的大麻素类物质，具有成瘾性[1-2]。合成大麻素则是2004 年以来，在大麻素替代品中发现与THC 结构相似的一类化学物质，属于新精神活性物质，是毒品市场上频繁出现的被称为“K2”“K3”“小树枝”“莫合烟”“娜塔莎” 等毒品的主要成分[3]，是种类最多、滥用最严重的第三代毒品。近年来，国际上对大麻物质合法化的呼声越来越高，多国放松了对食品中添加使用大麻素的管制，2019—2020年，我国多个海关在口岸截获了含有大麻素的蛋糕、巧克力等食品，其伪装性极强。目前，关于天然大麻素及合成大麻素类物质检测的报道，以毒品违法犯罪案件、物证鉴定的方法应用居多，主要集中于香料、血液、毛发等样品中[4-9]，以食品为基体进行检测的报道较少。其中，属于新精神活性物质的苯基异丙基酰胺系列的合成大麻素类物质从2015 年起才逐渐开始流行[10]，出现时间较短，其分析方法的研究较少，氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺类合成大麻素是近年来查获数量较多的合成大麻素类[11]，大麻素的滥用带来的成瘾性及对健康造成的危害不容忽视，2021 年7 月1 日起，我国成为全球首个整类列管合成大麻素类物质的国家[12]，因此对食品中合成大麻素类化合物也亟需建立检测方法。

目前，检测大麻素类化合物的常用方法包括液相色谱法[13-14]、液相色谱-质谱联用法[15]、气相色谱-质谱联用法[16]等，但基质多数集中于生物样本中。近年来，已有研究者开始关注食品中的大麻素类物质[17-19]，但食品中新型合成大麻素相关研究几乎空白，已无法应对当前国际上出现的含多种大麻素类食品的现状。本研究建立了超高效液相色谱-高分辨质谱法同时测定饼干、蛋糕、饮料3 种食品基质中6 种新型合成大麻素类化合物的方法，并且建立了基于高分辨质谱的合成大麻素类物质的特征二级碎片离子谱图库，同时研究了不同类别合成大麻素化合物的特征碎片来源，对识别含有新型合成大麻素类物质的食品和口岸进出境食品安全监测具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准溶液合成大麻素（ADBICA、AB-PINACA、ADBCHMINACA、CUMYL-THPINACA、CUMYL-4CNBINACA、CUMYL-5F-P7AICA）（纯度均≥95%，上海原思标物科技有限公司）；乙腈（色谱纯），甲酸（色谱纯），乙酸铵（色谱纯），乙酸锌（分析纯），亚铁氰化钾（分析纯），HLB 固相萃取柱（OASIS，6 mL，300 mg）；中性氧化铝（Alumina-N）固相萃取柱（CNW，500 mg，3 mL）；硅胶（Si）柱（CNW，500 mg，3 mL）。

饼干、蛋糕、饮料样品来源于入境检测样品或通过跨境电商购买。

1.2 仪器设备

Thermo Scientific Q Exactive 高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；摩尔超纯水器（重庆摩尔水处理设备有限公司）；3-30K 离心机（德国Sigma 公司）；KQ500E 系列超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；涡旋混合器（美国Scilogex 公司）。

1.3 样品前处理

饼干、蛋糕样品：准确称取1g 样品（精确至0.01 g）于50mL 离心管中，加入6mL 甲醇，使样品充分湿润混合；加入2 mL 220 g/L 乙酸锌溶液和2 mL 106 g/L 亚铁氰化钾溶液，超声15min，以3000r/min 离心3 min；准确移取5 mL 上层清液加入5 mL 水稀释，过经5 mL甲醇、5 mL 水活化后的HLB 柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，5 mL 甲醇洗脱后40℃下氮吹至近干；加入甲醇1 mL 涡旋混匀，过0.22 μm 滤膜待测定。

饮料样品：准确称取1 g 样品（精确至0.01 g）于50 mL 离心管中，加入1 g 氯化钠，加入10 mL 甲醇涡旋混匀；准确移取5 mL 上层清液加入5 mL 水稀释，过经5 mL 甲醇、5 mL 水活化后的HLB 柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，5 mL 甲醇洗脱后40℃下氮吹至近干；加入甲醇1 mL 涡旋混匀，过0.22 μm 滤膜待测定。

1.4 标准溶液的配制

取一定量固体标准品用甲醇溶解配制成1000 mg/L标准储备溶液，置于-20℃冰箱内避光保存。根据实际分析要求，用甲醇稀释成不同浓度的标准系列工作液。分别称取空白基体，按“1.3”样品前处理进行操作至氮吹近干，加入标准系列工作液，混匀，配制成基质系列工作溶液。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Waters C18色谱柱（200 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A 为甲醇，流动相B 为2 mmol/L乙酸铵溶液（0.1%甲酸）；梯度洗脱程序：0～1.0 min，10%A；1.0～2.0 min，10%A～40%A；2.0～3.5 min，40%A；3.5～5.0 min，40%～80%A；5.0～8.0 min，80%A；8.0～8.5 min，80%～10%A；8.5～10.0 min，10%A；流速：0.30 mL/min；柱温：40°C；进样体积：5μL；分析时间：10 min。

1.5.2 质谱条件

电喷雾离子（ESI）源：正离子模式；扫描方式：全扫描-自动触发二级扫描模式（full MS-ddMS2）；毛细管温度：500℃；喷雾电压：3 kV；最大驻留时间（Maximum IT）：50 ms；扫描范围：m/z 100～1 000；Top N：5；碰撞能量（步进值）：40 eV（50%）。新型合成大麻素信息参数见表1。

表1 新型合成大麻素名称等其他信息参数Table 1 Compound name and other information parametersof new synthetic cannabinoids

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本实验研究的合成大麻素类化合物整体极性中等偏低，因此采用反相色谱柱进行分离，比较了C18（Waters ACQUITY UPLC BEH C18，2.1 mm×100 mm，1.7μm）、HSS T3（Waters ACQUITY UPLC HSS T3，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色谱柱的分离效果及响应，结果表明，C18色谱柱对各化合物的分离效果优于T3柱，而不同色谱柱的品牌对分离效果并无显著差异，因此，选择C18作为分析柱。

本实验考察了不同流动相体系对大麻素类化合物的分离效果及化合物响应的影响，分别比较了甲醇、乙腈作为有机相，水、2 mmol/L 乙酸铵溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸铵溶液作为水相时待测物的分析情况，结果表明，水相中加入2 mmol/L 乙酸铵溶液时，化合物峰型得到明显改善，由于待测物的电离模式为正离子模式，加入适量甲酸有助于待测物的离子化，以增加响应，因此选择含0.1%甲酸的2 mmol/L 乙酸铵溶液作为水相。由于化合物极性的相似性，选择乙腈作为有机相时，化合物出峰较快且峰形较差，为兼顾溶剂效应和分离效果，本实验选择甲醇作为有机相。

2.2 质谱条件的优化

采用流动注射的方式，将大麻素类化合物混合标准溶液注入质谱仪，分别考察在正离子和负离子电离模式下大麻素类化合物的响应，实验表明，新型合成类大麻素在正离子模式下响应较好，负离子模式响应较低，因此采取正离子电离模式进行检测，并在相应的电离模式下优化方法的喷雾电压、碰撞气流速和碰撞能量等，优化好的参数下，各合成大麻素化合物的提取离子流图见图1。

图1 各大麻素类化合物的提取离子流图Fig.1 Chromatograms for ion extraction of various cannabinoid compounds

2.3 提取溶剂的优化

本实验考察了甲醇、乙腈、50%甲醇水溶液和50%乙腈水溶液作为提取溶剂时，各大麻素类化合物在饼干、蛋糕中、饮料中的提取效率，在样品中添加混合标准溶液，比较各化合物在不同提取溶剂下的回收率，结果见图2。结果表明，由于合成大麻素类化合物在甲醇、乙腈有机溶剂中溶解度较好，绝大部分化合物用甲醇提取时响应较好，加入沉淀剂可使饼干、蛋糕中的脂类和蛋白质沉淀，去除干扰。由图2 可知，各化合物在甲醇中的整体响应均优于甲醇水溶液，而在纯水中的的响应较差，因此选择甲醇作为提取溶剂。

图2 大麻素类化合物在不同提取溶剂中的响应Fig.2 Response of cannabinoids in different extraction solvents

2.4 净化方式的选择

由于食品样品基质复杂，饼干、蛋糕等基质油脂较多，部分样品在被直接提取离心后，其提取液上层会出现油脂，提取液直接过膜后，滤液浑浊，影响测定，因此方法需要进行净化。本文选择了Si、HLB、Alumina-N 3 种固相萃取柱对样品进行净化，比较不同固相萃取柱的净化效果，由图3 可知，Si 柱对大部分化合物的回收率较低，仅为46.4%～70.5%，HLB 净化时大部分化合物的回收率较高，优于Alumina-N 柱，因此在前处理过程采用HLB 固相萃取柱进行净化。

图3 不同固相萃取柱对大麻素类化合物的回收率Fig.3 Recovery of cannabinoid compounds by different SPE columns

2.5 标准曲线和定量限

分别以各合成大麻素化合物的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。以≥3 倍信噪比（S/N≥3）确定检出限（LOD），以≥10 倍信噪比（S/N≥10）确定定量限（LOQ），饼干和蛋糕中大麻素类化合物的LOD 为3 μg/kg，LOQ 为10 μg/kg，饮料中大麻素类化合物的LOD 为0.6 μg/kg，LOQ 为2 μg/kg。各化合物在1～500 μg/L 范围内线性关系良好，线性相关系数（R2）均＞0.999，大麻素类化合物的线性回归方程及相关系数详见表2。

表2 合成大麻素类化合物的线性回归方程及相关系数Table 2 Linear regression equation and correlation coefficient of cannabinoid compounds

2.6 回收率和精密度

在蛋糕、饼干空白食品基体中加入10 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg 的3 个浓度水平的标液，饮料中加入2 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg 的3 个浓度水平的标液，进行6 个平行测定，计算回收率和精密度。结果如表3 所示，合成大麻素类化合物在3 种不同食品基质中的3 个添加浓度水平的平均回收率为75.1%～106.7%。相对标准偏差（RSD）为2.5%～10.3%（n=6），表明该方法准确性和精密度较好，能够满足实际检测的需要。

表3 3 个添加水平下各化合物的平均回收率及精密度（n=6）Table 3 The average recovery and precision of each compound under 3 additive levels（n=6）

2.7 非定向筛查方法的建立

非定向筛查方法主要应用于暂时无法利用获取标准品或是对未知物种类数量无法确定的情况，可根据现有的数据库来识别风险化合物，进行定性确证。本研究利用高分辨质谱可自动触发进行二级质谱碎裂的特性，用建立的色谱质谱条件对混合标准品溶液进样分析，采用全扫描-自动触发二级扫描模式采集待测化合物的质谱信息，获取分子离子、碎片离子的精确质量数、保留时间等基础参数，导入数据库中，完善化合物的名称、分子式、扫描方式、化合物类别等信息，建立完整的化合物数据库。同时将标准品在确定的质谱条件下得到的二级质谱图导入谱图储存库中，建立完整的化合物全息数据库，利用Trace Finder 3.0 软件进行筛查。

为保证化合物能在通过数据库匹配的同时降低假阳性概率，优化设置的母离子精确质量数偏差为5 ppm，碎片离子精确质量数偏差为10 ppm，同位素丰度相似度90%，保留时间偏差在±2.5%内，谱图相似度比设置不小于0.60。若采集的色谱图满足母离子精确质量数偏差在5 ppm 内，保留时间偏差在±2.5%内（缺少标品可不考虑），可初步判定试样中含有相关化合物。进一步对碎片离子个数、同位素丰度相似度、二级谱图库匹配程度进行匹配，若以上条件均满足，可判定为阳性样品。本实验通过向空白样品中添加检出限水平的标液进行筛查分析，结果表明，加标样品中均能筛查出待测物。

2.8 高分辨质谱二级谱图分析

将合成大麻素类化合物标液在优化好的色谱条件下经Q Exactive 高分辨质谱仪分析，以全扫描-自动触发二级扫描（full MS-ddMS2）监测，采集不同类别大麻素的二级谱图，导入谱图库。结合大麻素类化合物母核、采集的二级特征碎片离子信息，推测出裂解规律。氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺类和苯基异丙基-酰胺系列合成大麻素的母核化学结构及二级碎片离子分别见图4 和图5，碎裂途径推测见图6。

图4 合成大麻素类化合物二级碎片离子图Fig.4 Secondary fragment ion diagram of synthetic cannabinoid compounds

图5 结构母核Fig.5 structure parent nuclei

图6 碎裂途径Fig.6 fragmentation pathway

由图4 可知，苯基异丙基-酰胺系列合成大麻素（CUMYL-THPINACA、CUMYL-4CN-BINACA、CUM YL-5F-P7AICA）的裂解途径大致分为2 种：一种是结构式中的苯基异丙基与相连的酰胺键断裂，形成苯基异丙基离子（m/z 119.085 5），进而形成卓鎓离子（m/z 91.054 2）；另一种是脱去苯基异丙基，形成吲哚酰胺离子，或是酰胺键断裂，形成吲哚氧离子。氨甲酰基吲哚/吲唑酰胺类合成大麻素（ADBICA、ABPINACA、ADB-CHMINACA）首先失去NH3，生成氨甲酰基吲哚/吲唑酰阳离子，氨甲酰基吲哚/吲唑酰阳离子进而发生酰胺键断裂，生成R2取代的吲哚/吲唑酰阳离子，脱去R2生成吲哚/吲唑酰阳离子（m/z 144.044 4 或145.039 6），氨甲酰基吲唑酰阳离子还有可能脱去CO，形成五元环。其碎裂途径推测见图5。

2.9 基质效应

基质效应（Matrix Effect，ME）是指样品在化学分析过程中，其干扰组分对分析物的分析过程有显著的增强或抑制效果，对结果的准确性产生影响。其计算方式为：ME（%）=B/A×100%，是指待测物在基质中的响应值与在纯溶剂中相同含量待测物的响应值之比。结果表明，在饼干、蛋糕、饮料样品中均存在不同程度的基体效应，通过对样品进行稀释和固相萃取的方式来降低基体效应，各基体的基体效应程度可降低至30%以下，处于中等强度或弱强度抑制范围内，能够满足检测要求。

2.10 实际样品的测定

用优化好的前处理及色谱质谱方法对来源于出入境检测样品及购买于跨境电商的饼干、蛋糕、饮料样品进行检测，结果表明，所有样品均无合成大麻素类化合物检出。

3 结论

本文建立了超高效液相色谱-串联质谱测定饼干、蛋糕、饮料3 种食品基质中多种大麻素类化合物的检测方法，能够同时测定多种合成大麻素类化合物。该方法采用基质配标法有效降低基质效应，线性范围广，回收率和精密度较好，能够满足目前国际上对合成大麻素类化合物的检测要求，为一线执法人员提供技术保障。同时，通过建立不同母核类型的大麻素类化合物二级谱图库，分析主要特征二级碎片离子，为无标准品对照条件下鉴定合成大麻素类化合物提供有效技术手段。