复方黄柏液涂剂促进Ⅲ度烧伤创面肉芽组织形成的作用机制研究

范炜 李烨

[摘要]目的：基于網络药理学和分子对接方法，确定复方黄柏液治疗的Ⅲ度烧伤肉芽组织愈合的有效活性成分、关键靶点和潜在的药理学机制，并进行肉芽组织成纤维细胞的初步验证。方法：从公共数据库中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索复方黄柏液组成成分连翘、黄柏、金银花的有效成分和靶点；GeneCards、OMIM数据库检索“Ⅲ度烧伤”疾病相关靶点。通过生物信息学分析，包括蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein interaction，PPI）以及基因本体（Gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，获得了关键的有效成分、核心靶点和相关信号通路；Discovery Studio分子对接分析有效成分化合物与靶蛋白的结合。0.5%的DMSO溶液处理的成纤维细胞记为对照组；槲皮素（40μmol/ml）处理的成纤维细胞记为槲皮素组。采用CCK8法、Transwell实验检测细胞增殖、迁移侵袭；WB试验检测细胞p-PI3K、p-Akt蛋白。结果：共筛选出74个有效成分，331个作用靶点，AKT1为潜在的治疗靶点，木犀草素、山柰酚、槲皮素、汉黄芩素、丹皮酚为潜在的候选药物。PI3K-AKT信号通路可能在复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤中发挥关键作用；分子对接表明槲皮素与AKT1结合最好。与对照组相比，槲皮素组成纤维细胞增殖、迁移侵袭均显著降低，p-PI3K、p-Akt蛋白表达也显著降低（P＜0.05）。结论：复方黄柏液促进Ⅲ度烧伤患者肉芽组织形成的生物活性成分为槲皮素，潜在通路为PI3K-AKT信号通路，为复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的研究提供了思路。

[关键词]复方黄柏液涂剂；Ⅲ度烧伤；网络药理学；分子对接；槲皮素；AKT1；PI3K-Akt信号通路

[中图分类号]R269    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2024）02-0045-06

Study on the Mechanism of Compound Huangbai Liquid Coating to Promote the Formation of Granulation Tissue on Third Degree Burn Wound

FAN Wei1，LI Ye2

（1.Office of the Fifth Hospital of Baoding，Baoding 071000，Hebei，China; 2.Department of Burns and Plastic Surgery，Baoding Fifth Hospital，Baoding 071000，Hebei，China）

Abstract： Objective  Based on network pharmacology and molecular docking method， the effective active ingredients， key targets and potential pharmacological mechanism of granulation tissue healing of third degree burn treated with compound phellodendron solution were determined， and the preliminary verification of granulation tissue fibroblasts was carried out. Methods  the effective components and targets of honeysuckle， Forsythia suspensa， Coptis chinensis and Phellodendron amurense， which was compound cortex phellodendri solution， retrieved from the public database tcmsp. Genecards and OMIM databases were used to search relevant targets of "third degree burn" diseases. Through bioinformatics analysis， including protein-protein interaction （PPI）， gene ontology （GO） and kyoto encyclopedia of genes and genomes （KEGG）， the key effective components， core targets and related signal pathways were obtained. Discovery studio molecular docking analysis of the binding of active ingredient compounds to target proteins. The fibroblasts treated with 0.5% DMSO solution were recorded as control group. Quercetin （40 μ mol/ml） were recorded as quercetin group. CCK8 method and Transwell test were used to detect cell proliferation， migration and invasion. The cell p-PI3K and p-Akt proteins were detected by WB test. Results  A total of 74 active ingredients and 331 action targets were screened. AKT1 was the potential therapeutic target， and luteolin， kaempferol， quercetin， wogonin and paeonol were the potential candidate drugs. PI3K-Akt signaling pathway may play a key role in the treatment of third degree burn with antipyretic and detoxifying compound cortex phellodendri solution. Molecular docking showed that quercetin combined well with AKT1. Compared with the control group， the proliferation， migration and invasion of quercetin fibroblasts were significantly reduced， and the expression of p-PI3K and p-Akt protein were also significantly reduced （P＜0.05）. Conclusion  The bioactive component of compound cortex phellodendri solution in promoting granulation tissue formation in patients with third degree burns is quercetin， and the potential pathway is PI3K-Akt signal pathway， which provides a new method for the treatment of burn with compound phellodendron solution

Key words： Compound cortex phellodendri solution; third degree burn; network pharmacology; molecular docking; quercetin; AKT1; PI3K-Akt signal pathway

网络药理学、分子对接可以相互补充地用于研究中医药，为活性化合物的筛选和机制探索提供新见解[1-3]，还能加快中医药现代化和国际化进程[4-6]。Ⅲ度烧伤患者皮肤全层烧伤，甚至伤及皮下组织及肌肉、骨骼，烧伤面积较大，病理机制复杂，其病情复杂治疗难度高、病程长、并发症多，伤残率和死亡率居高不下[7-11]。由于烧伤的预后常伴有瘢痕，临床上疗效好的新型护创、祛瘢产品昂贵、制作材料稀缺，普通患者难以负担[12-13]。清热解毒中药材在治疗烧伤中的临床历史有上千年，复方黄柏液可用于疮痈阳证[14]，其在烫伤中的临床效果得到患者的广泛认可，但是其作用机制研究甚少。本研究旨在通过网络药理学、分子对接及实验验证的方法探究复方黄柏液促进烧伤肉芽组织愈合的潜在机制。

1  材料和方法

1.1 有效成分分析：复方黄柏液由黄柏、连翘、金银花、蒲公英和蜈蚣组成。连翘与黄柏共为君药，可清热解毒、散结排脓，为疮家之圣药；臣药为金银花，佐药为蒲公英，可助君药解毒、排脓，使药蜈蚣则具有攻毒散结、退炎治疮之功。基于中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）检索连翘、黄柏、金银花三味中药的化学成分。有效成分的筛选条件为：OB≥30%，DL≥0.18。

1.2 药物-疾病靶点的筛选：TCMSP平台搜索连翘、黄柏、金银花的作用靶点，提取靶点的网络源代码，JSON工具转化为表格，利用UniProt数据库中的已验证基因将靶点蛋白全称转换为基因名的简称。四种中药的作用靶点经过重复项的删除即为药物靶点。GeneCards、OMIM数据库检索"deep second-degree burn"，收集有关Ⅲ度烧伤的疾病靶点，删除重复项后为疾病靶点。

1.3 药物-疾病靶点之间的网络关系：通过Venny 2.1绘制连翘、黄柏、金银花三味中药的化学成分韦恩图，展示四种药物有效活性成分之间的相互关系。使用线数据库STRING分析药物靶点和疾病靶点之间的蛋白相互作用（PPI）关系。将PPI数据导入Cytoscape 3.7.1，CytoNCA插件分析节点的Degree值，将60以上靶基因作为核心靶点，用于GO/KEGG功能富集分析。Degree值越高，节点的重要性越大。药物靶点和疾病靶点之间共有的靶点设为共有靶点，并对共有靶点进行PPI绘制。筛选核心靶点、共有靶点的Degree值排名均首位的靶点作为分子对接的蛋白受体。Cytoscape 3.7.1绘制药物-疾病靶点之间相互作用的网络关系图。

1.4 GO/KEGG功能分析：使用R语言及相关安装包对核心靶点进行GO/KEGG分析。具体包括排名前10的生物过程（Biological Process，BP）、细胞组分（Cell Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）展示和排名前20的KEGG通路展示。

1.5 分子对接：先在PDB蛋白质结构数据库（https：//www.rcsb.org/）搜索受体的蛋白结构式，筛选物种为人的近期得分排名靠前的蛋白，下载PDB格式，作为待用受体。TCMSP下载受体蛋白相关的活性成分分子结构式的Mol2格式。Discovery Studio 软件进行分子对接、优化。

1.6 难愈性肉芽组织中成纤维细胞的分离、鉴定及分组：创面的肉芽组织为笔者医院外科手术过程所取的术后废弃组织，然后快速在无菌条件下转移并进行成纤维细胞的分离、鉴定工作。患者知情同意并签有知情同意书。将组织用含有双抗的PBS充分清洗，眼科剪充分剪碎，胰酶消化30 min，过200目筛。滤液1 000 rpm/min离心5 min，用PBS重悬后分装置细胞培养瓶，培养过夜。48 h更换培养液，传代常规培养，使用3～5代的细胞用于本实验的研究。

1.6.1 鉴定：将第三代的肉芽组织成纤维细胞拍照，观察形态。取部分细胞进行波形蛋白的免疫组织化学染色。具体操作步骤：严格按照上海艾博抗的免疫组化试剂盒和试剂的说明书要求操作。成纤维细胞爬片后，PBS冲洗，洗去多余的培养液，3%过氧化氢固定，高温进行抗原修复，封闭后进行一抗孵育和二抗孵育，DAB染色，苏木素复染，封片。

1.6.2 分组：0.5%的DMSO溶液处理的成纤维细胞记为对照组；0.5%DMSO溶解的槲皮素（40μmol/ml）处理的成纤维细胞设為槲皮素组。

1.7 肉芽组织成纤维细胞增殖的检测：采用CCK8法检测细胞增殖能力，收集第三代的细胞接种96孔板，每孔1 000个细胞，分别培养24、48、72 h，加入CCK8溶液，避光孵育15 min，490 nm波长下检测细胞吸光值。

1.8 肉芽组织成纤维细胞迁移的检测：将第三代成纤维细胞接种至底部划线的6孔板，每孔1 ml，垂直底部的线划线，显微镜下观察，拍照，测量划痕宽度（cm）。再用无血清培养基培养24 h，观察拍照，测量划痕宽度（cm）。划痕愈合率（%）=（0 h宽度-24 h宽度）/0 h宽度×100%。

1.9 肉芽组织成纤维细胞PI3K-AKT信号通路活性的影响：收集第三代的成纤维细胞，RIPA冰上裂解，提取总蛋白。对上清蛋白进行定量和变性，取变性后的蛋白上清液进行SDS-PAGE蛋白电泳。结束后，将蛋白转移到NC膜，封闭液对膜封闭处理。用稀释过一抗溶液（1 000倍稀释的兔抗p-PI3K、p-Akt多抗）孵育4℃过夜，再用二抗溶液（500倍稀释的山羊抗兔二抗）37℃孵育2 h，用电化学发光法显色曝光，Image J软件分析条带的灰度值。兔抗p-PI3K、p-Akt多抗及山羊抗兔二抗均由上海艾博抗提供。

1.10 统计学分析：统计学专用软件SPSS 26.0分析实验数据。符合正态分布且方差齐的计量数据用x¯±s表示，两组间比较用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 复方黄柏液组分有效成分的分析：TCMSP得到连翘、黄柏、金银花的有效成分及OB，DL值，见表1。连翘有效成分22个，黄柏有效成分37个，金银花有效成分23个，删除重复项后为74个有效成分。

2.2 复方黄柏液作用靶点与Ⅲ度烧伤疾病靶点之间的相互作用：连翘1 013个靶点，去重后258个，黄柏1 162个，去重后222个，金银花1 347个靶点，去重后276个。中药的靶点756个，去重后得到331个药物靶点，Ⅲ度烧伤疾病靶点1 276个，删除重复后1 120个。药物靶点与疾病靶点的相互作用图见图1A，Degree值60以上的90个核心靶點之间的网络图见图1B，药物与疾病之间共有靶点155个及其相互作用图见图1C。药物-疾病相互作用靶点Degree值排名第一的为AKT1，该基因的蛋白作用图见图1D。Cytoscape 3.7.1绘制药物-有效成分靶点-疾病靶点-Ⅲ度烧伤之间的网络图发现各药物、有效成分、靶点与Ⅲ度烧伤之间具有相互作用，并且关系错综复杂。

2.3 复方黄柏液-Ⅲ度烧伤核心靶点的GO/KEGG富集分析：将复方黄柏液-Ⅲ度烧伤靶点Degree值超过60的核心靶点绘制GO功能富集气泡图，见图2。按照生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）三部分各取排名前10的部分展示，其中BP中的功能富集的量及差异相对最丰富，涉及脂多糖、细菌及氧化应激等生物反应。将核心靶点进行KEGG富集分析，取排名前20的通路绘制气泡图，见图3，其中PI3K-Akt信号通路在中药与疾病之间的富集最丰富。

2.4 AKT1与复方黄柏液之间的分子对接结果：根据中药-疾病核心靶点、共有靶点Degree值筛选出AKT1关键靶点。AKT1蛋白3os5作为蛋白受体，木犀草素（MOL000006）、山柰酚（MOL000422）、槲皮素（MOL000098）、汉黄芩素（MOL000173）、丹皮酚（MOL000874）作为小分子配体。其中木犀草素、山柰酚为金银花、连翘共有的有效成分，槲皮素为连翘、黄柏共有的有效成分。AKT1与配体分子结合位点的3D图见图4，2D分子结合位点见图5，可见结合分子以精氨酸（Arginine，ARG）、天冬氨酸（Aspartic acid， ASP）为主。分子对接结合能结果显示，这些成分均可很好地结合到靶蛋白的活性位点。其中，AKT1与槲皮素的对接结合能最低（-5.22 kcal/mol），与汉黄芩素的对接结合能最高（-2.31 kcal/mol），平均结合能为-3.70 kcal/mol。可见，候选化合物与候选靶蛋白之间分子对接具有特定的结合活性。见表2。

2.5 肉芽组织成纤维细胞鉴定：肉芽组织成纤维细胞显微镜下呈梭形规则排列（见图6A）；免疫组织化学检测Vimentin蛋白呈棕黄色（见图6B）。

2.6 槲皮素对肉芽成纤维细胞增殖、迁移的影响：与对照组相比，槲皮素组细胞24、48、72 h的增殖能力均显著升高，细胞划痕愈合率也显著升高（P＜0.05），见表3、图7。

2.7 槲皮素对肉芽成纤维细胞PI3K-Akt信号通路活性的影响：与对照组相比，槲皮素组细胞p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著降低（P＜0.05），见表4、图8。

3  讨论

烧伤创面的愈合是一个复杂的过程，可能会导致一些器官系统的结构和功能的缺陷[15]。复方黄柏液涂剂治疗2～3周后，创面愈合明显优于未给药患者，组织中的生长因子表达升高，炎症反应和细胞凋亡均降低[16]。此外其在临床上对四肢Ⅱ度烧伤具有显著效果，表现为缓解创面周边的炎症反应、预防创面的细菌感染，降低患者的疼痛感，加快创面的愈合[17]。这说明金银花、连翘、黄柏在治疗烧伤中确实具有较好的临床效果，但是，这些中药发挥作用的有效化合物及其与烧伤之间的相关性尚不清楚。本研究发现，同时满足OB≥30%，DL≥0.18的金银花有效化合物23个，连翘22个，黄柏37个，去重后剩余74个。这说明了复方黄柏液是通过多个化合物发挥烧伤愈合作用的。进一步分析发现，这74个有效成分的作用靶点有331个，而Ⅲ度烧伤的疾病靶点1 120个，他们的核心靶点有90个，共有靶点155个，其中AKT1是药物与疾病之间相互作用最紧密的基因。AKT1很可能是复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的关键作用靶点。

为了探究复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的潜在机制，进行了GO/KEGG富集分析。结果显示复方黄柏液与Ⅲ度烧伤的核心靶点中生物过程富集最丰富，主要集中在脂多糖、细菌及氧化应激等反应，相关的通路有PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE等多条信号通路，说明了复方黄柏液是通过多个生物过程、多条通路治疗烧伤的，其中PI3K-Akt信号通路在其中发挥的作用可能最为重要。

AKT1作为复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的最具潜力靶基因及作用通路因子，其发挥作用的潜在分子机制仍需探究。本实验发现，AKT1与金银花、连翘的有效成分木犀草素、山柰酚，连翘、黄柏的有效成分槲皮素、汉黄芩素、丹皮酚均存在对接的氨基酸，主要为精氨酸、天冬氨酸。除此之外，AKT1与清热解毒中药有效成分之间的平均结合能为-2.31 kcal/mol，低于-4.25 kcal/mol，呈现出特定的结合活性。这些结果进一步揭示了清热解毒中药治愈烧伤的分子机制与AKT1特定结合精氨酸、天冬氨酸等多种氨基酸有关。

进一步通过分离、培养肉芽组织成纤维细胞发现，复方黄柏液主要有效化合物槲皮素对成纤维细胞的增殖、迁移侵袭能力的增强具有明显的促进作用，这说明槲皮素对肉芽组织的愈合有刺激作用。除此之外，研究还发现，槲皮素对PI3K-Akt信号通路的活性有抑制作用，说明了该通路确实参与复方黄柏液治疗Ⅲ度烧伤的创面恢复过程。

综上，复方黄柏液通过多种有效成分、多种生物、细胞、分子相关通路、结合多种氨基酸发挥治疗Ⅲ度烧伤作用，其中槲皮素功效最大。槲皮素可抑制肉芽组织成纤维细胞增殖、迁移和侵袭，其机制与失活PI3K-Akt信号通路有关，为复方黄柏液用于临床治疗Ⅲ度烧伤奠定了理论基础。

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[收稿日期]2022-10-27

本文引用格式：范炜，李烨.复方黄柏液涂剂促进Ⅲ度烧伤创面肉芽组织形成的作用机制研究[J].中国美容醫学，2023，33（2）：45-51.