全基因组测序技术在结核病中的应用进展

郑婷婷 向菲

[摘要] 全基因组测序是高通量测序技术，因偏倚小、成本不断降低等优势而广泛应用于疾病的临床诊断和研究中。近年来，结核病带给全球公共卫生的压力不容小觑。目前，全基因组测序技术在结核病诊断、耐药性检测、致病机制研究及其传播防控等方面面临诸多挑战。本文阐明全基因组测序技术在结核病中的最新应用进展。

[关键词] 结核病；全基因组测序；耐药结核病；结核分枝杆菌

[中图分类号] R52    [文献标识码] A     [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2024.03.026

结核病（tuberculosis，TB）是一种十分常见的慢性传染病，其致病病原体是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），可通过气溶胶传播。《2022年全球结核病报告》[1]显示，截至2021年全球TB的患病人数仍有1000万人，同时有>160万例TB患者因此死亡。受菌株变异及感染人数增加等影响，临床逐渐出现耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）等TB患者，进一步加重全球公共卫生的压力。提高MDR-TB的检出率、阻断其传播、研发新药和疫苗等变得更为迫切。

1998年，Cole等[2]公布了MTB菌株H37Rv包含的约440万个碱基对和4000个基因在内的完整基因组序列，加深了人们对MTB的认识。2017年，英国成为全球第一个应用全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）技术在全国范围内开展MTB诊断、耐药性检测、菌株鉴定和分型的国家[3]。Walker等[4]发布了第一个被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）认可的13种抗TB药物的基因组突变目录。

1  MTB与基因组测序

在第一种脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）测序技术出现后的20多年中，基因组学技术迅猛发展。下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术应运而生。2021年，Athanasopoulou等[5]提出第三代测序技术，其具有长读取、高速度、短用时等优势，可弥补NGS的部分缺陷，但其应用亦受到技术和成本的限制。

结核分枝杆菌复合体（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）的宏基因组测序包括样本准备（样本去污提纯、培养、提取细菌DNA）、制备文库、读取序列及数据分析等流程[6]。目前，WGS的工作流程尚未标准化，用于MTBC-WGS分析的自动化管道有MTBseq、UVP等，其可快速调用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），在短时间内分析大量的MTBC基因组数据。ILLumina MiSeq及Nanopore MinION等测序仪可应用于WGS。DNA纳米孔测序更为便携，价格合理，耗时较短，且可读取长度为150kb序列[7]。

2  WGS在TB中的应用

2.1  WGS在TB诊断和耐药性检测中的应用

在既往研究中，TB诊断多依赖于传统细菌学证据。WHO建议用筛查的方法发现TB高危人群，人工智能等新型技术手段已用于改善TB诊断的影像学方法中[8]。诊断技术的更迭与进步更多地发生于分子诊断方面，具有高度特异性和敏感度的核酸扩增试验彻底改变既往的诊断格局。WHO推荐常用的TB诊断方法包括线性探针检测、GeneXpert MTB/RIF检测技术、环介导等温扩增检测及WGS等[9]。

WGS被认为是具有巨大发展潜力的分子诊断方法，其较常规诊断方法的速度更快。Votintseva等[10]研究推测，应用WGS技术有望于24h内确诊患者是否为TB。一项多中心、前瞻性研究表明，基于WGS技术的实验室诊断成本较常规诊断的费用少7%[11]。但为获取足够数量的细菌，在行WGS前还需对临床标本进行细菌培养，从而限制了其应用。新型靶向基因组测序技术可直接对临床样本进行分析，无需培养检测，缩短中位周转时间[12]。但该过程并未实现标准化，仅限于已知的抗性标志物。

MTB对多数抗生素具有天然抗性。除原发高水平抗生素耐药性外，还有继发新获得突变导致的抗生素耐药机制，包括基因突变、药物外排泵、降解修饰、细胞包膜的非渗透性、靶点的改变和模拟等[13]。一线分子诊断方法GeneXpert MTB/RIF仅可检测利福平的耐药性、识别DNA突变，识别特定耐药突变的数量有限[14]。

在MTB基因组数据的支持下，WGS可筛选出所有与其表型耐药性相关的决定性突变因素。研究表明，WGS检测抗结核药物的敏感度在80%以上，而表型药物的敏感度则不到80%[15]。Papaventsis等[16]研究显示，WGS对利福平检测的敏感度和特异性相似，略高于异烟肼。Wang等[17]研究指出，WGS在预测一线抗结核药物方面较二线药物具有更高的敏感度和特异性，但WGS可能无法检测出尚未确定和新出现的突变。杨婷婷等[18]的研究构建基于WGS数据分析和共享的耐药和传播监测网络、建立SAM-TB平台，对17种抗结核药物的耐药性进行预测并分析遗传关系，优化人们对于易感及耐药TB患者的管理。Huang等[19]对357株MDR-TB進行WGS，提供迄今为止最全面的18种抗结核药物的药物敏感度测试结果。

2.2  WGS在MTB致病机制研究中的应用

MTB可持续存在于机体内，虽临床症状多不明显，但会使机体不断地产生免疫应答，这称为潜伏性结核感染，是活动性TB孵化的温床。Penn- Nicholson等[20]目前正在开展可预测潜伏性结核感染进展为活动性TB的生物学标志物的相关研究。越来越多的研究开始致力于通过全基因组转录组学方法揭示MTBC与人宿主间复杂的免疫反应。

基因组学的比较分析有助于增强人们对MTB致病机制的理解。目前，MTBC包含7种与人类关系密切的地理分布不同谱系[21]。通过比较MTBC完整基因组序列与其近亲海洋分枝杆菌发现，MTBC是从祖先的环境分枝杆菌进化而来的，经历广泛的横向基因转移，最终成为人类和某些其他哺乳动物的特殊致病病原体[22]。＞0.5kb的多态性区域被定义为差异区域或“RD”位点，其缺失可能与细菌毒力丧失有关，这是卡介苗基因组毒力衰减的基础[23]。

卡介苗是目前唯一获得许可的TB疫苗，虽其可使儿童播散性TB在一定程度上获得控制，但其在青少年及成人TB中收效甚微。研究发现，标记转座子诱变技术可识别和筛选MTB菌株在感染过程中减毒表型的突变体[24]。转座子测序技术将转座子诱变和基因组测序结合起来，尝试探索MTB生存所必需的基因[25]。突变体将转座子插入染色体中编码参与特定脂质合成和运输酶的70kb片段中，这些脂质成分通过限制和规避巨噬细胞中的自噬途径使MTB获得持续性生长[26]。应用转座子定点杂交技术可确定MTB感染多个阶段生长所需的194个候选基因[27]。

MTB代谢基因组学研究表明，脂肪酸的分解、赖氨酸和亮氨酸的合成、铁的合成、碳循环等均与菌株体内感染相关，脂质和氨基酸是MTB的营养来源[28]。另有研究证实，MTB主要通过阻断吞噬体成熟、酸化及溶酶体融合、降解蛋白酶体等途径实现宿主体内的持续感染[29]。

2.3  WGS在TB传播和防控中的应用

WGS已成功应用于MTBC分离株的研究中。与传统检测方法相比，WGS可提供MTB的菌株分型及耐药性等方面的全面数据，从而可利用WGS识别TB在人群中的传播情况，包括社区、学校、国家甚至是国际疫情暴发环境中[30]。

在分子流行病学层面，TB主要应用基于聚合酶链反应的标准化基因分型方法，即将24位点分枝杆菌散在分布重复单元-可变数目串联重复序列（Mycobacterial interspersed repetitive unit-variable number tandem repeat，MIRU-VNTR）和间隔寡核苷酸分型相结合[31]。与标准IS6110限制性片段长度多态性技术相比，MIRU-VNTR的速度更快，所需DNA样本量更少，但二者的分辨力相差不大。然而有临床研究表明，MIRU-VNTR对基因组密切相关（即遗传距离在0～5个SNP以内）的菌株预测能力较差[32]。

与传统标准化基因分型方法相比，WGS可更好地预测TB的传播事件，特别是在确定TB传播范围方面；它能进一步划分MIRU-VNTR等传统基因组方法分离出的簇，在一定程度上减少漏诊病例的发生[33]。与此同时，WGS在分化复发和再感染病例中也具有较高的效率[34]。Jajou等[35]研究表明，在对分离株进行基因分型时，WGS与传统方法的一致性为86%，而WGS确定的流行病学相关性却是传统基因分型方法的2倍。WGS在识别与流行病学相关的MTB分离株方面的敏感度较高，在部分研究中可达100%，但特异性与环境相关[36]。这一结论在另一项研究中得到证实[37]。因此，更推荐将WGS应用于TB发病率较低的环境中。

WGS还可鉴定不同菌株之间的SNP，有助于排除虚假传播事件，确定患者之间MTB的传播方向[38]。同时，利用基于SNP的方法可进行谱系和基因分型分析，进一步探索MTBC的多样性。但因无法利用WGS对基因组的重复区域进行准确分析，WGS的数据分析仍存在一定的变异性。TB低负担环境相关研究认为，最近的传播是由5个或更少的SNP距离引起的。但在高TB发病率和耐药TB流行环境中，由于在正选择压力下的基因位点具有更高突变率，导致WGS在获得耐药性的患者之间观察到的SNP数量大于预期[39]。同时，Nelson等[40]研究推测，WGS可能无法明确患者是否可归因于近期传播。

一项来自中国上海的人群层面的TB相关研究，应用WGS和流行病学方法评估324例患者MDR-TB分离株的近期传播情况，描述MDR-TB的传播模式，构建耐多药菌株的传播网络[41]。Jiang等[42]描述深圳地区MDR-TB的传播情况，结果显示学校和工作场所是应当被重视的TB筛查区域。

3  前景和挑战

在基因组测序中，目前建立的TB相关测序数据平台包括MUBII-TB-DB、TBDReaMDB、ReSeqTB等。这些平台可汇总全球相关的基因组和表型信息，用户可直接获取与MTB相关的元数据，促进TB诊断和监测，指导TB的国际化管理。Pan等[43]建立基于WGS的信息传输分析管道TransFlow，其建立在Snakemake工作流程引擎之上，具有全面高效、用户友好、简便易用、可视化等特点。WGS平台的建立需要大量的人力、物力和财力资源，以满足基础设施等建设需求。这些都对低收入和中等收入国家提出了前所未有的挑战。

WGS在临床中的应用主要受限于高昂的测序价格及结果分析缺乏统一的解释标准。另外，WGS需从临床样本中培养并分离病原体，从周转时间看，尚无法完全替代常规微生物学方法。WGS对治疗效果的改善及基因型和表型间的一致性缺乏数据验证。因此，实现从实验室到临床应用的转化任重道远，需要开展更多的研究以评估其性能和可用性。未来，应在优化测序流程、降低测序成本和周轉时间、开发更多端到端的用户友好型测序分析管道等方面为之努力。

利益沖突：所有作者均声明不存在利益冲突。

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