不同类型堆肥中腐殖酸与富里酸的光谱特性和分子量分布

陈 丹,程 澳,余旭芳,纪文超,2,刘健健,2,王 翔,2,刘晓龙,范行军 ,2①

(1.安徽科技学院资源与环境学院,安徽 凤阳 233100;2.安徽省生物炭与农田污染防治重点实验室,安徽 蚌埠 233400)

随着畜禽养殖业的迅速发展,畜禽粪便对生态环境的污染日益突出。堆肥是实现畜禽粪便无害化和资源化的最有效途径[1-2]。畜禽粪便堆肥是一类性质稳定且富含养分的腐殖质类产品,施用于土壤后不仅能提供养分,还有利于恢复及改善土壤的理化性质[3-4]。堆肥是一种通过微生物作用不断降解有机废弃物,同时生成大量的高度聚合且稳定的腐殖质(humic substances, HSs)的生物化学过程[5]。堆肥HSs主要包括腐殖酸(humic acid, HA)和富里酸(fulvic acid, FA),具有十分复杂的化学结构和环境效应。堆肥HSs富含高度共轭的芳香族结构,能有效提高土壤的抗逆性,改善土壤的稳定性[6]。堆肥HSs中的酚羟基、羧基和氨基等活性基团具有较强的金属络合潜势,能够显著影响土壤重金属的迁移和转化[7-8]。堆肥HSs同时含有复杂的芳香族、蛋白质和多糖结构,能显著影响其电子接收能力和电子供给能力,从而影响土壤重金属及有机污染物的氧化还原程度[9]。堆肥HSs的化学组成和分子结构是影响其环境效应的重要因素。堆肥原料的理化性质对堆肥HSs的形成和结构等具有重要影响[3,5]。原料中的木质素和纤维素能够促进高腐殖化程度的HSs形成[10];而类蛋白质和类酚结构能提升微生物降解速率,促进堆肥HSs的聚合生成[11-12]。不同辅料添加对堆肥HSs的生成和物质转化也有重要作用。ZHAO等[12]研究指出,添加不同类型作物秸秆对污泥堆肥HSs的生成量、生成速率及HA/FA相对组成等均有着不同的影响。尽管已有大量基于小型(或模拟)堆肥实验的HSs定量和表征研究[3, 6, 10],但是目前针对不同类型工业化生产堆肥HSs的分离定量和化学表征等的研究甚少。因此,为更好地认识堆肥化学性质、环境行为及其农艺适用性,开展不同类型堆肥中HSs的化学组成和分子结构等的研究具有十分重要的意义。

中药渣、小麦秸秆和稻壳是常用的堆肥物料或与畜禽粪便共堆肥的辅料[13-15],当前在皖北地区已被广泛应用于有机肥生产。该研究以这3类工业化生产的鸡粪堆肥为对象,采用紫外-可见光光谱(UV-vis)、三维荧光(EEM)光谱、红外光谱及高效体积排阻色谱(HPSEC)等对堆肥中HA和FA的光谱特征和分子量进行系统表征。通过光谱参数、三维荧光区域体积积分(EEM-FRI)、官能团组成和分子量分布等分析,进一步探究不同类型堆肥中HA和FA的化学组成及分子结构特征,研究结果可为有效评估堆肥腐熟程度、堆肥产品质量以及农业应用性能等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 堆肥收集及处理

研究所用堆肥采自安徽省阜阳市、亳州市多家大型有机肥生产企业,包括分别以中药渣、小麦秸秆和稻壳为辅料的鸡粪工业化堆肥。鸡粪原料与添加辅料的干物质质量比基本为4∶1,堆肥持续时长为40～60 d。3类堆肥的基本理化性质如表1所示,有机质和总养分均符合NY/T 525—2021《有机肥料》标准。为便于后续化学表征,堆肥产品需进行冷冻干燥并研磨过0.15 mm孔径筛。最终处理得到分别添加中药渣、小麦秸秆和稻壳的堆肥样品,并依次标记为HR、WS和RH。

表1 不同辅料鸡粪堆肥的基本理化性质

1.2 腐殖质分离与纯化

HA与FA分离和纯化的方法参见文献[1]。具体步骤如下:取干燥过筛样品按固液比(m∶V)为1∶10 加入0.1 mol·L-1的Na4P2O7与0.1 mol·L-1的NaOH混合溶液。在25 ℃恒温振荡器中,以150 r·min-1连续振荡浸提24 h。然后将混合液在 8 000 r·min-1下离心30 min(相对离心力为6 790 g),上清液用0.45 μm孔径滤膜过滤。将滤液pH值调至1后置于水浴锅中70 ℃持续加热1 h,于暗处静置过夜,该液体视为FA和HA已经完全分离。将沉淀用NaOH重新溶解,加HCl使HA沉淀,沉淀以稀HCl及超纯水洗涤2～3次,得到HA。上清液用XAD-8型树脂进行吸附,后用0.1 mol·L-1的NaOH冲洗树脂并收集洗脱液,随后通过H型阳离子交换树脂进行脱盐并收集流出液,得到FA。将纯化后的HA和FA进行冷冻干燥,制得固体粉末,待测试。

图1 鸡粪堆肥HA和FA的分离纯化

1.3 仪器分析

1.3.1紫外-可见光光谱分析

测试前分别取一定量的HA和FA加入超纯水进行再溶解,配制成溶解性有机碳(DOC)质量浓度为10 mg·L-1的溶液样品。利用岛津UV-2600紫外-可见光分光光度计进行吸收光谱扫描,扫描范围为200～700 nm。所有样品吸收光谱均以超纯水作为空白进行背景扣除。

1.3.2三维荧光光谱分析

采用日立F-4600荧光分光光度计测定EEM光谱。激发波长(Ex)和发射波长(Em)扫描范围分别设置为200～400和290～520 nm,狭缝宽带均设为5 nm,扫描速度为2 400 nm·min-1。所有样品EEM均以超纯水作为空白进行背景扣除。

1.3.3傅里叶变换红外光谱(FTIR)

将1 mg经冷冻干燥的HA或FA粉末与200 mg KBr(光谱纯)混合后充分研磨,利用红外磨具压制成光滑薄片。采用Nicolet iS50 FTIR红外光谱仪(Thermo,美国)进行FTIR光谱测定,扫描范围为400～4 000 cm-1,分辨率为 4 cm-1,扫描波数为64。所有样品扫描条件完全一致,同时以KBr作为空白扣除仪器背景值。

1.3.4元素分析

准确称取2 mg冷冻干燥的HA和FA粉末样品,采用A3000型元素分析仪(Euro Vector,意大利)测定样品的C、H、N元素含量,O含量通过100%减去C、H、N元素的质量分数计算得到。

1.3.5高效液相体积排阻色谱分析

采用Polysep-GFC-P3000(Phenomenex)型凝胶色谱柱和Polysep-GFC-P型保护柱对HA和FA进行分子量分离。利用高效液相色谱仪(LC-20AT, Shimadzu,日本),并配备折射率检测器(RID, 岛津)和二极管阵列检测器(SPD-6A, 岛津),采集不同分子量组分在254 nm处的吸收信号。以V(甲醇)∶V(超纯水)=1∶9且含有25 mmol·L-1乙酸铵的混合液作为流动相,流速维持在1 mL·min-1,进样体积为100 μL。以系列聚乙二醇标准品(分子量分别为238、601、1 020、3 450、4 080、11 100、17 900 和41 300 Da)对色谱柱分离进行校正,校准曲线如图2所示。

MW—相对分子质量。

根据下列公式计算HA和FA的重均相对分子质量(Mw)、数均相对分子质量(Mn)以及分散系数(ρ)[16]:

(1)

(2)

ρ=Mw/Mn。

(3)

式(1)～(3)中,m为检测器的响应次数;hi为洗脱时间i时检测曲线的响应值;Mi为洗脱时间i时的相对分子质量。

1.4 数据处理

HA和FA溶液样品测试均设3次重复。三维荧光区域体积积分采用Matlab R2017b软件计算,试验数据由Excel 2010软件进行整理和统计分析,相关图形采用Origin 2021软件进行绘制。

2 结果与讨论

2.1 HA和FA的UV-vis光谱特征

图3为3种堆肥中HA和FA的紫外-可见光光谱(以DOC校正)。可以看出,HA和FA的吸光度均随波长的增加而降低,表现出典型的腐殖质UV-vis光谱特征[17]。HA和FA在280 nm左右均呈现出一个弱吸收平台,此处吸收峰一般与木质素降解产物和醌类结构有关[3],说明这类物质和结构是堆肥HA和FA中的重要组分。不同类型堆肥中HA的UV-vis吸收强度表现为HR>RH>WS,说明HR具有最强的芳香度,其次为RH,而WS的芳香度最低。HR堆肥中HA与FA具有较强的芳香度,可能与中药渣富含半纤维素、纤维素、多糖和木质素等有重要关系[18],堆肥过程中微生物活动会将这类碳源转化为高度共轭和芳香化的腐殖质。不同类型堆肥中FA吸收强度在不同波长范围内存在一定的差异。例如,在>260 nm区域,HR的吸收强度高于RH;在220～320 nm区域,HR和RH的吸收强度均高于WS。以上结果均表明,不同类型堆肥中HA和FA的分子组成和结构均存在差异,说明不同辅料对鸡粪堆肥产品的腐殖质组成和性质具有重要的影响。值得注意的是,不同类型堆肥中HA的校正吸光度均明显高于FA,表明HA具有更强的芳香度和腐殖化程度[3]。

HR—中药渣;WS—小麦秸秆;RH—稻壳。

SUVA254值可以表征HA和FA的化学组成和性质,其值与腐殖质的芳香度、腐殖化程度及分子量大小呈正相关[19]。该研究中,不同类型堆肥中HA的SUVA254值表现为HR〔(20.85±0.42) L·mg-1〕>RH〔(16.40±0.90) L·mg-1〕>WS〔(13.10±0.13) L·mg-1〕;FA组分的SUVA254值则表现为HR〔(7.71±0.16) L·mg-1〕≈ RH〔(7.79±0.10) L·mg-1〕>WS〔(6.52±0.02) L·mg-1〕。对于不同类型堆肥,HR中HSs(HA或FA)的芳香性、腐殖化程度及其分子量要高于RH和WS中的HSs。一般而言,堆肥HSs的芳香性和腐殖化程度越高,其化学稳定性越强[3]。由此说明,小麦秸秆添加堆肥的稳定性相对较弱,中药渣或稻壳添加堆肥施入土壤后更有益于提升土壤有机质的化学稳定性[6]。对于不同类型HSs,堆肥HA的SUVA254值为对应FA的2.0～2.7倍,反映出HA的芳香化和腐殖化程度要明显高于FA。

2.2 HA和FA的EEM-FRI分析

图4显示了3类堆肥HA和FA的EEM光谱。不同类型堆肥中HA具有类似的EEM光谱特征,均存在一个显著的荧光峰(Ex=260～265 nm,Em=460～485 nm),该峰位于典型的腐殖酸荧光区域[20]。同时,不同FA也具有相似的光谱特征,均在Ex=210～225 nm、Em=410～425 nm处呈现明显的荧光峰,位于典型的富里酸荧光区域[21],表明添加不同类型辅料对鸡粪堆肥中腐殖质的荧光特征影响不明显。然而,HA和FA的EEM光谱存在明显差异。由图4可见,HA的主荧光峰相对FA存在明显的红移,表明前者具有较高的腐殖化程度和高分子量特征[22],这与LANNO等[3]报道的不同类型堆肥HA和FA的EEM特征类似。此外,FA在类蛋白物质荧光区域(Ex=200～300 nm,Em=290～380 nm)也存在较明显的荧光信号,说明类蛋白物质亦是FA的重要化学组分,这与污泥蚯蚓堆肥FA的EEM特征相似[23]。

根据CHEN等[24]的研究,可以将HA和FA的EEM光谱分为5个区域(图4)。各荧光区域归属参见文献[20,24],具体信息如表2所示。将各个区域荧光强度进行区域体积积分(FRI),并以此计算不同区域百分比(图5),进而揭示不同类型堆肥中HA和FA的荧光组成特征。

HR—中药渣;WS—小麦秸秆;RH—稻壳。荧光积分区域Ⅰ～Ⅴ划分见表2。

表2 荧光积分区域划分及归属

由图5可见,不同类型堆肥中HA均以类富里酸(Ⅲ)和类腐殖酸(Ⅴ)荧光物质组成为主,相对含量分别为41%～44%和43%～48%。FA中类富里酸(Ⅲ)含量最高(35%～44%),类腐殖酸(Ⅴ)和类色氨酸(Ⅱ)也是其重要组成部分,相对含量分别为20%～25%和22%～23%。对于不同堆肥而言,HA的荧光物质组成差异不明显,而不同辅料添加对FA的结构影响较为显著。其中,WS和RH堆肥FA中类腐殖质荧光组分较多(Ⅲ+Ⅴ,63%～64%),而HR堆肥FA的类络氨酸组分较多(Ⅰ,14%)。对于不同类型HSs来说,HA中类腐殖质(Ⅲ+Ⅴ)物质的含量(86%～91%)要显著高于FA(56%～64%);而FA中类蛋白(Ⅰ+Ⅱ)物质含量(28%～37%)要远高于HA(5%～9%)。研究指出,类腐殖酸与类富里酸含量比值(Ⅴ/Ⅲ)能够有效评估堆肥的腐殖质含量[25]。该研究中,不同堆肥HA的Ⅴ/Ⅲ比值差异不明显,分布在1.0～1.1之间;而不同类型堆肥FA的Ⅴ/Ⅲ比值具有一定的差异,其中HR和WS的Ⅴ/Ⅲ比值(0.60～0.66)高于RH(0.45),表明后者的腐殖质含量相对较低。相对而言,堆肥HA的V/Ⅲ比值均高于FA,表明HA具有更高的腐殖化程度和更强的化学稳定性[25],这与UV-vis光谱揭示结果一致。

2.3 HA和FA的官能团组成

HR—中药渣;WS—小麦秸秆;RH—稻壳。

不同类型堆肥中HA的光谱特征十分类似,说明辅料添加对堆肥HA官能团结构的影响不明显,然而不同类型堆肥中FA的分子结构存在一定的差异。HR堆肥中FA含有丰富的芳香族羧酸结构(1 645 和1 210 cm-1),WS堆肥中FA富集较多的酰胺(1 560 cm-1)和羧酸(1 410 cm-1)结构,稻壳RH堆肥中FA具有较多的酰胺(1 645和1 560 cm-1)和多糖结构(1 034 cm-1)。已有研究指出,堆肥HSs中的羧基和氨基等能与重金属发生络合,影响其迁移、转化和生物毒性[7-8]。WS堆肥中FA富含酰胺和羧酸结构,可提供更多的重金属络合活性基团。此外,FA普遍比HA含有更多的酰胺和羧酸结构,这与已报道的牛粪堆肥HSs的官能团组成特征相似[30],说明堆肥HA具有更加稳定的化学结构。

2.4 HA和FA的元素组成

由表3可知,不同类型HA的C含量(49.0%～53.1%)明显高于对应类型堆肥中FA的C含量(23.6%～49.6%);HA的O含量(35.3%～37.0%)则显著低于对应FA的O含量(38.9%～68.3%)。C/H比可以反映有机质的结构和性质,其值一般与有机质芳香化和腐殖化程度呈正相关[30]。该研究中,HA和FA的C/H比基本表现为HR>RH>WS。表明HR堆肥中HA和FA的芳香性和不饱和程度最高,化学性质更为稳定[30];而WS堆肥中HA和FA的脂肪化程度最高,化学稳定性相对较差[30],该结果同SUVA254的表征结果一致。C/N比可以表征HA和FA的腐殖化程度,其值越大则腐殖化程度越低[30-31]。从表3可知,HA的腐殖化程度高于FA,这可能与HA形成时发生的固氮作用及含氮分解产物的聚合等有关[31]。相对而言,RH堆肥的HA和FA均表现出较低的C/N比,说明RH堆肥HSs的腐熟度较高,且含有更多的有机氮(如氨基等)结构[30-31],进而能向土壤提供更多的稳定态有机氮成分[31]。O/C比能够表征HSs含氧官能团的相对含量,比值越大说明含氧官能团含量越高[31]。由表3可知,FA的O元素含量和O/C比都高于HA,说明FA中含有更多的含氧官能团[32]。WS堆肥中FA的C/H比最低(4.1),O/C比最高(2.9),说明WS堆肥中FA的芳香化程度较低,氧化性基团较多,这与其FTIR中1 410 cm-1处具有显著的吸收峰结果一致,表明其富集有较多的羧酸基团。

表3 鸡粪堆肥中HA和FA的元素组成

2.5 HA和FA的分子量分布

分子量是评估堆肥腐殖质腐熟程度的重要指标。采用HPSEC观测不同类型堆肥中HA和FA的分子量大小及分布,分析结果如图7所示。

Mw—相对分子质量;HR—中药渣;WS—小麦秸秆;RH—稻壳。

由图7可以看出,不同类型HA的分子量分布基本相似,主要分布在1×102～3×105Da之间,在0.5和11.7 kDa左右具有显著吸收峰,并且在99.5 kDa左右具有弱吸收峰。不同FA也具有类似的分子量分布范围,主要在1×102～4×104Da之间。其次,不同类型FA均呈现出3个明显的特征吸收峰,包括0.5、1.8、4.1(或5.6) kDa左右,说明不同类型FA都包含相似的3类分子簇。不同堆肥中FA的特征吸收峰位置和吸收强度存在一定的差异,特别是高分子量(4.1或5.6 kDa左右)特征组分。HR中FA高分子量特征组分的相对吸收强度最高,其次为WS,RH最低。同时,HR中FA的高分子量特征吸收组分(5.6 kDa左右)比WS和RH中FA(4.1 kDa左右)具有更高的分子量。相对而言,HA具有比FA更宽的高分子量分布特征(>4×104Da)以及更高的特征吸收峰分子量(11.7 kDa),表明HA具有更多的高分子量有机组分。ZHAO等[33]发现,不同类型畜禽粪便和作物秸秆等堆肥中HA均由高分子物质(>2×104Da)组成。

由表4可知,不同类型HA的平均Mw分布在14 389～17 328 Da之间,平均Mn分布在1 292～1 563 Da之间,均表现为HR>RH≈WS。不同类型FA的平均Mw分布在4 331～5 148 Da之间,平均Mn分布在770～1 068 Da之间。其中,HR堆肥中FA的Mw和Mn最高,表明添加药渣有助于增加鸡粪堆肥的分子量和稳定性,而RH和WS堆肥含有较多的低分子量HSs,从而更易被土壤微生物利用而发生物质转化[33]。HA的Mw和Mn分别为FA的2.7～3.1和1.5～1.6倍,表明HA的分子量普遍显著高于FA。这与SUVA254表征结果一致,表明HSs中共轭结构和芳香结构与其分子量分布有着密切关系。

表4 鸡粪堆肥中HA和FA的Mw和Mn

3 结论

(1)UV-vis和EEM-FRI分析结果显示,堆肥的HA具有比FA更高的芳香度和腐殖化程度。中药渣和稻壳添加堆肥HA和FA的芳香性高于小麦秸秆添加堆肥。不同堆肥中HA具有相似的荧光物质组成,均以类腐殖酸(43%～48%)和类富里酸(41%～44%)为主,而FA均以类富里酸(35%～44%)为主。不同辅料添加堆肥FA中类腐殖质含量存在差异,稻壳添加堆肥FA含有最多的类富里酸,而小麦秸秆添加堆肥FA含有最多的类腐殖酸。

(2)FTIR和元素分析表明,堆肥HA和FA均含有芳香族和脂肪族羧酸及酚类等结构。HA的不饱和度与芳香度比FA更高,而FA比HA含有更多的含氧官能团,包含较多的酰胺和羧酸等基团。不同辅料添加堆肥中FA的化学结构存在差异,中药渣添加堆肥中FA的不饱和度和腐殖化程度最高,含有较多的芳香族羧酸结构,小麦秸秆添加堆肥中FA含有大量的酰胺和羧酸结构,而稻壳添加堆肥中FA具有较多的多糖结构。

(3)HPSEC显示,堆肥HA的分子量分布(102～2×105Da)比FA(102～2×104Da)更宽,表明HA具有更多的高分子量有机组分和更高的分子量。不同辅料添加对堆肥中HA和FA的分子量具有重要影响,HA和FA的Mn均表现为HR>RH>WS,表明中药渣添加鸡粪堆肥分子量最大,高分子物质相对含量及腐熟度最高。