电子鼻结合生物胺分析淡水鱼贮藏过程中的品质变化

刘琳，焦文娟，赵甜甜，张友胜，周芳，南海军*，张业辉*，黄文

（1.广东药科大学中药学院，广东广州 510006）（2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业农村部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室,广东广州 510610）（3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东广州 510642）（4.广东省农业科学院水产研究所，广东广州 510645）

我国是水产养殖大国，2021 年水产品全国总产量高达6 690.29 万t，同比去年增长了2.16%，淡水产品产量3 303.05 万t，同比增长2.11%，我国淡水渔业呈现良好的发展趋势[1]。目前，我国淡水鱼养殖产量居世界第一，主要以鲜活鱼的方式进行运输和销售，新鲜度直接决定消费者的接受程度。淡水鱼中的蛋白质、多不饱和脂肪酸等营养物质含量较高，且体内组织蛋白酶活性强，易滋生腐败微生物。面对如此复杂的鱼体环境，在贮运过程中鱼肉极易腐败，品质变化明显，以致造成巨大的经济损失。因此，有必要对淡水鱼在贮藏过程中的品质变化进行研究，为后期保鲜及加工方面提供参考。

鱼肉腐败变质分为僵直期、解僵期及自溶期三个阶段，一般在第二阶段开始滋生大量微生物，此时品质最佳，随后鱼肉的粘性变大且散发出恶臭气味[2]。在品质变化过程中，鱼体的理化指标都会发生相应的变化，比如硬度、组织微观结构、pH 值、TCA 溶解肽值细胞凋亡和自溶程序等[3]。随着贮藏时间的延长，蛋白质分解产生氨及胺类等碱性物质，脂质酸败产生醛和酸类物质，会导致pH 值不断波动，呈现先下降后上升的趋势，鱼肉的色泽逐渐变暗，生物胺的种类和含量也不断增加。此外，随着鱼肉新鲜度降低，肉中挥发性物质含量（硫化物、氮氧化物等）逐渐增加，气味变化可作为新鲜度评价的一个直观指标。电子鼻是近年兴起的新型检测技术，具有简便、无损等特点，在食品、药品气味检测中广泛应用，使用电子鼻作为测定气味变化的仪器，可有效避免人为误差。陈东杰等[4]利用电子鼻采集了0 ℃贮藏的海鲈鱼气体指纹信息，结果表明利用电子鼻对海鲈鱼新鲜度品质进行快速检测具有可行性。

本研究选取草鱼、罗非鱼和鳙鱼三种淡水鱼，探究其在25 ℃（常温）和4 ℃（冷藏）两种温度贮藏过程中的品质变化。采用主成分分析（PCA）对电子鼻测定的挥发性气味物质进行处理，同时对样品的总挥发性盐基氮（TVB-N）和生物胺（BAs）的浓度进行评估，并结合pH 值、色泽以及硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）等相关指标，研究不同指标之间的相关性，建立一种快速对淡水鱼新鲜度品质判别的方法，旨在为我国淡水鱼保鲜加工研究提供一个切实有效的技术方案，对促进我国水产品加工技术水平的提升和扩大生鲜淡水鱼制品产业规模有重要的理论参考和应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活草鱼（1 000±150 g）、鳙鱼（1 000±150 g）和罗非鱼（500±50 g），购自广州天河区华润万家超市；腐胺、尸胺、酪胺、组胺、色胺、苯乙胺、精胺、亚精胺、丹黄酰氯，色谱纯，购于美国sigma 公司；三氯乙酸、氧化镁、戊二醛、乙醇、无水乙醇（分析纯），购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、丙酮，色谱纯，购于美国Fisher Chomical 公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（LC-1200），安捷伦仪器有限公司；pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；H2P-250 型恒温培养箱（控温精度±0.1 ℃），上海精宏实验设备有限公司；PEN3 型电子鼻，德国Airsense 公司；色差仪（CR-400）：柯尼卡美能达（日本）公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理及分组

鱼宰杀、去头、去尾、去鳞、去鱼鳍、去内脏。挥发性气味检测取相同部位同等质量鱼肉（5.00 g）检测。将预处理的鱼肉切块，用袋子抽真空密封包装，分为两组（每组样品12 个）。第一组放入设定为25 ℃恒温生化培养箱中保存48 h，第二组放入设定为4 ℃冰箱中保存12 d。第一组每隔12 h，第二组每隔48 h，进行取样，平行三次，分别测定挥发性气味物质、生物胺、挥发性盐基氮（TVB-N）等指标。

1.3.2 色差测定

使用色差仪测定鱼肉样品的色彩空间参数，在L*（亮度）、a*（红度-绿色）和b*（黄度-蓝色）中测定。使用公式（1）评估贮藏样品和新鲜样品之间的总色差（ΔE），如下所示：

式中：

L*、a*、b*——是贮藏样品的颜色值；

L0*、a0*、b0*——是新鲜鱼的颜色值[5]。

1.3.3 pH值的测定

在GB 5009.237-2016 基础上稍加改动[6]，取5.00 g样品于烧杯中，加入50 mL 蒸馏水，均质后离心10 min，转速7 000 r/min，取上清液测定鱼肉pH 值。每个样品平行3 次。

1.3.4 电子鼻测定

将2.00 g 切碎的鱼肉置于50 mL 顶空瓶中，并用三层保鲜膜密封，然后在测量前静置30 min[7]。参数设定：进样时间5 s，传感器清洗时间60 s，气流流速400 mL/min，数据采集时间为180 s。PEN3型电子鼻的10 个传感器性能描述见表1。

表1 PEN3型电子鼻传感性能描述Table 1 Description of sensing performance of PEN 3 electronic nose

1.3.5 TVB-N值测定

参照GB5009.228-2016 中的微量扩散法[8]。

1.3.6 TBARS值测定

依据GB 5009.181-2016 中的方法进行测定[9]。

1.3.7 生物胺测定

根据Wang 等[10]方法稍作修改，对生物胺进行分析。用三氯乙酸溶液提取，丹磺酰氯衍生，0.45 μm 滤膜过滤，最终注入配备有对称C18 柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）的高效液相色谱仪（Agilent 1200，Agilent，USA）。紫外检测波长254 nm，进样量20 μL，流速0.8 mL/min。以标准混合工作液浓度为横坐标，目标化合物的峰面积为纵坐标，制作标准曲线。并以衍生溶液的峰面积和保留时间定性，根据标准曲线对样品中的生物胺进行定量分析。

1.3.8 数据处理与分析

实验所得数据在SPSS 26.0 软件中使用邓肯检验在单因素方差分析中进行显著性分析，电子鼻数据处理与分析在内置程序（Winmuster，version 1.6.2）内进行，所有图形均使用Origin 2021 绘制。

2 结果与分析

2.1 色差的变化

鱼肉生理结构、内部化学反应以及微生物繁殖会导致外部颜色发生变化，肉色决定着消费者的购买行为，可直接作为肉质优劣感官评价的一个重要指标[11]。亮度值（L*）、红度值（a*）、黄度值（b*）和总色差（ΔE）可全面反映色泽的变化。一般来说，红度值越高，鲜肉品质越好[12]。ΔE表示贮藏前后鱼肉表面颜色的变化，ΔE越大，表明可接受程度越低。

如表2 和表3 所示，在25 ℃和4 ℃两种不同温度的贮藏过程中，淡水鱼的L*值、a*值、b*值及ΔE呈现类似的趋势。淡水鱼L*值随着贮藏时间的增加而降低，a*值不断减小，而ΔE跟b*值在增大，且差异显著（P＜0.05）。淡水鱼在相同贮藏时间下，在25 ℃贮藏条件下色泽变化的程度高于4 ℃贮藏，比如，经过48 h 的贮藏，草鱼（25 ℃）的L*值从61.05 降至46.24，a*值从-1.18 降至-1.79，b*值从2.11增至3.01，ΔE变化为14.84，而在4 ℃贮藏48 h 后，L*值下降至58.61，a*值下降至-1.36，b*值增大至2.24，ΔE变化为2.46。新鲜鱼肉呈现鲜红色或暗红色，其颜色主要受血红蛋白和肌红蛋白的影响[13]。随着贮藏时间的延长，鱼肉的表面积累了肌肉组织中的高铁血红蛋白和高铁肌红蛋白，导致鱼肉发生褐变反应，L*值不断降低，鱼肉颜色由最初的鲜亮逐渐变为暗淡，失去光泽[14]。同时，在整个贮藏过程中，微生物大量滋生，脂肪受到氧化物质的影响产生脂质过氧化物，高铁肌红蛋白的含量逐渐增多，从而导致a*值降低，肉色逐渐变黄，b*值增大[15]。

表2 25 ℃贮藏条件下3种淡水鱼色差分析Table 2 Color difference analysis of three kinds of freshwater fishstored at 25 ℃

表3 4 ℃贮藏条件下3种淡水鱼色差分析Table 3 Color difference analysis of three freshwater fish storedat 4 ℃

2.2 pH值的变化

pH 值是水产品新鲜度的评价指标之一。如图1所示，在整个贮藏过程中，pH 值呈现先降低后升高的趋势。原因可能是贮藏初期鱼类细菌发酵发生糖原酵解、ATP 降解和脂肪分解，这些反应会引起有机酸的形成和积累，使肌肉整体pH 值下降[16]。贮藏后期，鱼肉内源性蛋白酶或微生物产生挥发性碱组分（例如氨和三甲胺），导致pH 值上升[17]。25 ℃贮藏24 h 后，三种鱼pH 值达到最低值，草鱼、罗非鱼、鳙鱼的pH 值分别为6.38、6.38 和6.42。4 ℃贮藏的第4 天，鳙鱼pH 值最低6.39，而草鱼和罗非鱼在第6 天pH 值达到最低，分别为6.44 和6.38，表明贮藏温度及时间会影响pH 值的变化程度。此外，鱼体pH 值还与鱼的种类、生长环境、捕捞环境及后期加工处理等有关。

图1 3 种淡水鱼pH 值变化Fig.1 Changes in pH of three freshwater fishes

2.3 电子鼻分析

电子鼻因具有灵敏的化学传感器和模式识别系统，通过样品的响应信号得到综合的评价信息，实现对样品的香气和口感信息进行简单的对比分析，鱼肉的风味可以通过电子鼻检测[18,19]。如图2b 和2d 所示，25 ℃贮藏48 h 后，W5S（对氮氧化物灵敏）的响应值最高，4 ℃贮藏12 d 后，W1W（对硫化物灵敏）的响应值最高，另外，W2W（对有机硫化物灵敏）的响应值也明显增大。这一结果可能是因鱼肉腐败变质，导致蛋白质分解产生了硫化物、甲烷和氮氧化物，同时也表明，较低的贮藏温度可以减缓鱼肉的风味变化。

图2 3 种淡水鱼PCA 图和风味雷达图Fig.2 PCA and flavor radar of three kinds of freshwater fish

采用PCA 对电子鼻的响应值进行分析，结果如图2 所示。从图2a 可看出，在25 ℃贮藏的淡水鱼前两个主成分贡献率分别为86.7%和5.8%，累积贡献率达92.5%，表明前两个主成分能较好代表总体数据信息。新鲜样品与其他样品相距较远，说明新鲜样品与其他样品存在显著差异，样品新鲜与否可明显区分。而贮藏12 h 与24 h 样品间相距较近且完全分开，表明样品间也存在差异，但与新鲜样品距离较远，此时样品已经开始腐败，新鲜度降低，品质变差。贮藏36 h 和48 h 的样品气味归为一类，说明品质已经变差。由图2c 可看出，4 ℃贮藏淡水鱼的第一主成分贡献率为61.2%，第二主成分贡献率为19.0%，累积贡献率达80.2%。贮藏8 d、10 d和12 d 的样品相距很近，说明此时三种淡水鱼样品已经腐败，新鲜度降低。电子鼻可清晰分辨不同新鲜度鱼肉样品的气味，随着贮藏时间的延长，鱼肉样品的挥发性气味发生了明显变化，不同贮藏时间样品气味的响应值没有重叠，PCA 区分结果显示，基于电子鼻数据进行品质评价的效果较好。

2.4 TVB-N值和TBARS值分析

TVB-N 和TBARS 是食品中两个常用的新鲜度理化指标。TVB-N 值是指肉或肉制品在酶和腐败微生物的作用下产生碱性含氮物质的总含量[20]。如图3所示，在整个贮藏期间，TVB-N 和TBARS 呈现类似的趋势。当TVB-N 值达到15 mg N/100 g 时，肉类和肉制品的微生物腐败和变质达到不可接受的水平[21]。由图3a 可见，在常温25 ℃下贮藏12 h，罗非鱼的TVB-N 值从7.93 增加到17.50 mg N/100 g，鳙鱼从最初的7.00 增加到15.17 mg N/100 g，说明此时罗非鱼和鳙鱼样品开始腐败，贮藏24 h 后，草鱼的TVB-N 值超过了15 mg/100 g，肉质已经腐败。由图3b 可见，在4 ℃贮藏过程中，随着贮藏时间的增加，三种淡水鱼的TVB-N 值显著增加（P＜0.05），罗非鱼的TVB-N 值为18.43 mg N/100 g（4 d），草鱼和鳙鱼的TVB-N 值都超过15 mg N/100 g（6 d），表明此时肉质逐渐变坏，已超出消费者的接受水平。吴玉婷等[22]研究鮸鱼贮藏品质变化，25 ℃贮藏24 h时TVB-N 含量为36.53 mg/100 g，而4 ℃贮藏9 d时TVB-N 超过30 mg/100 g，表明低温环境有利于抑制酶活和微生物生长速度，具有较低的TVB-N 值。TVB-N 值越高，肉质腐败越严重，品质越差。

图3 25 ℃和4 ℃贮藏条件下3 种淡水鱼TVB-N 和TBARS 的变化Fig.3 Changes in TVB-N and TBARS of three kinds of freshwater fish stored at 25 ℃and 4 ℃

TBARS 值可以有效反映脂肪氧化的程度，变化如图3c 和3d 所示，新鲜草鱼的TBARS 含量为0.22 mg MDA/kg，25 ℃贮藏24 h 后，TBARS 含量迅速增长至0.87 mg MDA/kg。相比于25 ℃贮藏条件，4 ℃的TBARS 值增长相对较慢，可能是因为低温能有效抑制脂质的氧化。由于不饱和脂肪酸在氧化过程中产生的脂质氢过氧化物和过氧化物降解产物逐渐积累[23]，TBARS 值跟贮藏温度和时间呈正相关。

2.5 生物胺分析

生物胺（BAs）是一种具有芳香族，脂肪族或杂环结构的含氮化合物，主要通过氨基酸的脱羧产生[24,25]。虽然BAs 对人体的生物功能起着重要的调节作用，但摄入过量会导致严重的生物胺中毒[26]。腐胺和尸胺被认为是鱼腐坏的主要指标[27]，贮藏时间和温度对生物胺种类和含量的影响如表4 和表5 所示。

表4 25 ℃贮藏条件下3种淡水鱼生物胺含量Table 4 Biogenic amines contents of three kinds of fresh water fish stored at 25 ℃(mg/kg)

表5 4 ℃贮藏条件下3种淡水鱼生物胺含量Table 5 Biogenic amines contents of three kinds of freshwater fish stored at 4 ℃(mg/kg)

新鲜鱼均未检测到色胺、腐胺和尸胺，而25 ℃贮藏12 h 和4 ℃条件下贮藏6 d 后，都检测到8 种生物胺（色胺、组胺、腐胺、尸胺、酪胺、苯乙胺、精胺和亚精胺），说明此时淡水鱼开始腐败变质，新鲜度开始降低，品质逐渐变差。经25 ℃贮藏12～48 h，草鱼、罗非鱼、鳙鱼腐胺含量分别由6.12、7.83、7.50 mg/kg 增加到33.94、40.05、32.93 mg/kg。但在4 ℃贮藏2 d 后，淡水鱼样品中检测到腐胺，草鱼、罗非鱼和鳙鱼的含量依次为4.51、3.67、4.02 mg/kg，远低于25 ℃贮藏2 d 的淡水鱼。在4 ℃贮藏12 d 后，草鱼、罗非鱼和鳙鱼的腐胺含量增加至30.59、23.03、19.82 mg/kg。由此可见，25 ℃贮藏腐胺含量增长更快。25 ℃贮藏12 h 后，三种淡水鱼中检测到尸胺，然而4 ℃条件下贮藏第6 天才检测到尸胺，说明25 ℃贮藏12 h，4 ℃贮藏6 d，开始腐败。随着贮藏时间的延长，淡水鱼中生物胺含量显著增加（P＜0.05），相比之下，25 ℃贮藏条件下增长得更快，这一结果与尤娟等[28]研究相似，低温可以有效抑制生物胺的产生。影响微生物生长的重要因素是贮藏温度和时间，延长储存时间和/或提高储存期间的温度会增加生物胺浓度[29]。

2.6 贮藏过程中生物胺含量、电子鼻响应值与TVB-N、TBARS、pH及色差的相关性

从表6 可看出，在25 ℃贮藏条件下，草鱼中亚精胺与电子鼻传感器W5S 响应值表现出极显著相关性（P＜0.01），苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、精胺与W5S 响应值表现出显著相关性（P＜0.05），相关系数高于0.898，生物胺与TVB-N、TBARS、L*、a*、b*和ΔE均达到显著性相关水平（P＜0.05）。罗非鱼中尸胺及精胺与W5S 响应值表现出极显著相关性（P＜0.01），苯乙胺、腐胺、组胺、酪胺及亚精胺与W5S 响应值表现出显著相关性（P＜0.05），相关系数高于0.903。鳙鱼中苯乙胺及精胺与W5S响应值表现出极显著相关性（P＜0.01），腐胺、尸胺、组胺及酪胺与W5S 响应值表现出显著相关性（P＜0.05），相关系数高于0.890。罗非鱼和鳙鱼中生物胺（苯乙胺和精胺除外）与TVB-N、TBARS、L*、a*、b*和ΔE均达到显著性相关水平。W5S响应值与三种淡水鱼的TVB-N 具有显著相关性（P＜0.05），与草鱼的TBARS 及色差指标具有显著相关性（P＜0.05），与罗非鱼和鳙鱼的色差具有显著相关性（P＜0.05），但与TBARS 无显著相关性。但三种淡水鱼中pH 与生物胺及电子鼻传感器W5S响应值无显著相关性。综上所述，相关性结果分析表明可将腐胺、尸胺、组胺、和酪胺作为淡水鱼在25 ℃贮藏条件下的特征生物胺，特征生物胺及电子鼻传感器W5S 响应值与TVB-N 显著相关，可以用来判断淡水鱼的鲜度变化。

表6 25 ℃贮藏条件下3种淡水鱼生物胺含量结合电子鼻与其他指标的相关性Table 6 Correlation between biogenic amine content,electronic nose and other indexes of three freshwater fish stored at 25 ℃

从表7 中可看出，三种淡水鱼中生物胺与电子鼻传感器W1W 和W2W 的响应值具有极显著相关性（P＜0.01），相关系数高于0.919，与W5S 响应值、TVB-N、TBARS、L*、a*、b*和ΔE均达到显著性相关水平。鳙鱼中生物胺（腐胺、酪胺和精胺除外）与pH 值具有显著相关性（P＜0.05），相关系数高于0.764，但草鱼和罗非鱼生物胺与pH 值无显著相关性。W5S 响应值与草鱼的TVB-N 及a*值表现出显著相关性（P＜0.05），与罗非鱼和鳙鱼的TVB-N、TBARS 及色差指标达到显著相关性水平；W1W 和W2W 响应值与三种淡水鱼的TVB-N、TBARS、及色差指标均达到显著性相关水平；W1W响应值与草鱼和罗非鱼的pH 值无显著相关性，但与鳙鱼pH 值表现出显著相关性（P＜0.05），相关系数为0.767。在进行新鲜度分析时，pH 仅作为参考，需结合其他新鲜度指标。三种淡水鱼生物胺及电子鼻传感器W1W 和W2W 的响应值与TVB-N 具有极显著相关性（P＜0.01），而电子鼻传感器W5S与TVB-N 具有显著相关性（P＜0.05），生物胺结合电子鼻传感器W1W、W2W、W5S 的响应值可以用来判断淡水鱼的鲜度变化。

表7 4 ℃贮藏条件下3种淡水鱼生物胺含量结合电子鼻与其他指标的相关性Table 7 Correlation between biogenic amine content,electronic nose and other indexes of three freshwater fish stored at 4 ℃

3 结论

分析了不同贮藏温度（25 ℃和4 ℃）三种淡水鱼（草鱼、罗非鱼和鳙鱼）的相关理化指标的变化情况，三种鱼虽种类不同，但在贮藏期间，其理化指标都呈现出了相似的规律。随着贮藏时间的延长，TBARS 及TVB-N 含量逐渐增加，pH 值呈现出先降后升的规律，生物胺种类和含量增加，电子鼻的响应值随之变大，b*值、ΔE逐渐增大，而L*值和a*值整体趋势在下降；相关性分析表明25 ℃贮藏条件下淡水鱼特征生物胺（腐胺、尸胺、组胺、和酪胺）及电子鼻传感器W5S 响应值与TVB-N 显著相关（P＜0.05），4 ℃贮藏条件下淡水鱼生物胺及电子鼻传感器W1W 和W2W 的响应值与TVB-N具有极显著相关性（P＜0.01）；根据电子鼻响应值及生物胺含量判定三种淡水鱼在25 ℃贮藏条件下的货架期为12 h，在4 ℃贮藏条件下的货架期为6 d，PCA 分析可区分不同贮藏时间的样品，电子鼻结合生物胺分析对淡水鱼新鲜度品质评价具有可行性。以上研究结果为我国淡水鱼的保鲜加工提供了理论依据。