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碱性蛋白酶水解时间对玉米谷蛋白理化性质及抗氧化活性的影响

2024-02-27刘晓兰郑喜群姜彩霞李冠龙

中国粮油学报 2024年1期
关键词:谷蛋白二硫键溶解性

董 原, 刘晓兰, 郑喜群, 孟 杰, 姜彩霞, 李冠龙

(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院1,齐齐哈尔 161006) (黑龙江省玉米深加工理论与技术重点实验室2,齐齐哈尔 161006) (黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术中心3,大庆163319) (齐齐哈尔市检验检测中心4,齐齐哈尔 161005)

玉米是世界上总产量最多的粮食作物,具有广泛的经济和社会价值。玉米蛋白粉(CGM)是玉米湿磨工艺的主要副产物,含质量分数约67%~71%的蛋白质[1]。CGM蛋白含有丰富的疏水性氨基酸、亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸,被认为是制备生物活性肽的良好来源[2]。玉米谷蛋白约占CGM总蛋白质质量分数的30%,是一种复杂的大分子蛋白质,由大约20个分子质量为11~127 ku的蛋白质亚基构成[3]。玉米谷蛋白中含有丰富的谷氨酰胺,能够有效促进肠道代谢和提高人体免疫力[4,5]。由于玉米谷蛋白中大部分蛋白质亚单位通过二硫键和疏水键相互作用紧密相连,因此在水溶液中很难溶解[6,7]。为了扩大玉米谷蛋白在食品工业中的应用,必须改善其溶解性和其他功能性质。

酶法水解主要是通过生物酶破坏主链中的肽键修改蛋白质结构,从而达到改善蛋白质溶解性和其他功能性质。另外水解产物常含有一定量的二肽和三肽,使其具有更好的吸收作用[8,9]。Jiang等[10]利用复合蛋白酶水解玉米谷蛋白鉴定出4种具有不同抗氧化活性的新肽,具有较高的羟自由基清除能力。碱性蛋白酶能水解具有广泛特异性的蛋白质,由碱性蛋白酶制备的水解物显示出更好的溶解性和良好的生物活性[11]。王彬彬等[12]和崔宁等[13]分别采用碱性蛋白酶和双酶协同水解玉米谷蛋白的方法制备的水解物具有较高的抗氧化活性,并对乙醇诱导损伤的LO2细胞具有保护。目前利用碱性蛋白酶水解玉米谷蛋白改善其功能特性的研究较少,本研究通过探究不同水解时间获得的玉米谷蛋白水解物的表面疏水性、二硫键含量、热性能、分子质量分布、溶解性、乳化性、起泡性及其抗氧化活性,为玉米谷蛋白水解物的应用推广提供技术支持,以期将谷物副产物转化为功能性食品和营养剂。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米蛋白粉:黑龙江省;碱性蛋白酶(2.1×105U/g);ANS,DNTB,Ellman,抑肽酶,杆菌肽,蓝色葡聚糖2000均为色谱纯;其他试剂均为分析纯。

RF-5301PC型Versafluor荧光计系统,1100高效液相色谱,DSC-60 Plus差示扫描量热仪,CR30NX冷冻离心机,Millrock真空冷冻干燥机。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米谷蛋白的制备

称取一定量经挤压膨化和脱淀粉后的玉米蛋白粉按1∶10(g/mL)加入丙酮搅拌30 min以去除色素,经4 000 r/min 离心15 min收集沉淀物,再按照1∶10(g/mL)加入体积分数为70%乙醇溶液于60 ℃水浴中浸提2 h,经4 000 r/min 离心15 min收集沉淀物以去除醇溶蛋白。所得沉淀物经低温烘干后按1∶10(g/mL)加入0.1 mol/L NaOH溶液于60 ℃水浴中浸提2 h,冷却至室温,离心收集上清液,调节pH值至4.8,离心得沉淀后分别经体积分数为70%乙醇溶液和蒸馏水洗涤3次,冷冻干燥得玉米谷蛋白。

1.2.2 玉米谷蛋白水解物的制备

称取一定量玉米谷蛋白与pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(0.02 mol/L)配制成质量分数为5%的蛋白悬液,碱性蛋白酶添加量为1 g/100 g底物、温度为60 ℃、水解时间90~180 min,沸水浴15 min终止反应。经5 000 r/min离心15min上清液进行冷冻干燥。

1.2.3 水解度的测定

根据文献[13]中的表述,采用pH-stat法。

1.2.4 蛋白含量的测定

采用福林酚法[14]测定可溶性蛋白含量。

1.2.5 二硫键含量测定

参照Wen等[15]和Tang等[16]的方法测定玉米谷蛋白及其水解物的巯基含量(SH)和二硫键含量(SS)。

式中:D为稀释系数(6.08);C(mg/mL)为受试样品中的蛋白质含量;A412为412 nm处相对于试剂空白的吸光度。

1.2.6 表面疏水性的测定

参照Zheng[17]的方法,使用ANS作为疏水荧光探针,准确称取30 mg样品溶于10 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.0),经10 000 r/min离心10 min,上清液用0.22 μm滤膜过滤,经磷酸盐缓冲液将样品质量浓度稀释至0.01 ~0.02 mg/mL。取其中5 mL样品溶液与25 μL 8 mmol/L ANS溶液混合,在390 nm(激发光)和470 nm(发射光)波长处测量其荧光强度。通过线性回归分析计算相对FI与蛋白质质量浓度(mg/mL)图的初始斜率(S0),并将其用作表面疏水性(H0)的指数。

1.2.7 差示扫描热量法(DSC)的测定

称取干燥的样品约3 mg于预先称重的铝盒,并从0 ℃加热至200 ℃,加热速度为10 ℃/min。以空铝盒对对照,利用相关软件计算峰值温度(Tp)和总热量焓(ΔH)。

1.2.8 分子质量分布的测定

利用高效液相色谱(HPLC)法测定玉米谷蛋白及其水解物的分子质量分布。上样量为5 μL,色谱柱为Superdex肽10/300 GL柱(10 mm×300 mm),洗脱液为含0.15 mol/L NaCl溶液的20 mmol/L PBS缓冲液(pH 7.0),流速0.25 mL/min。以标准抑肽酶(6.5 ku)、杆菌肽(1.4 ku)作对照。利用蓝色葡聚糖2 000(2 000 ku)测量柱的空隙体积。在214 nm处监测洗脱液的吸光度。

1.2.9 玉米谷蛋白及其水解物理化性质表征

参照文献[11]的方法测定样品的溶解度。另外将样品配制成质量分数为1%的蛋白质溶液,参照文献[18]分别测定样品的乳化性与乳化稳定性、起泡性与泡沫稳定性。

1.2.10 玉米谷蛋白水解物抗氧化活性测定

参照JIN[19]的方法测定玉米谷蛋白水解物的DPPH自由基清除率、羟自由基(·OH)清除率以及Fe2+螯合率,其中样品质量浓度为2 mg/mL,以质量浓度0.01 mg/mL的抗坏血酸(VC)作为阳性对照组。

1.3 数据处理

所有数据均测量3次,结果以“平均值±标准误差(SD)”表示。通过方差分析(ANOVA)比较不同组别之间的差异性(P<0.05),并利用Origin2019绘图。

2 结果与分析

2.1 玉米谷蛋白的水解

课题组前期实验结果表明碱性蛋白酶水解玉米谷蛋白的最适底物质量分数为5%、pH 8.0、温度为60 ℃、碱性蛋白酶添加量为1 g/100 g底物。本研究以水解度(DH)和可溶性蛋白含量为指标考察不同水解时间60、90、120、150、180 min对玉米谷蛋白水解物的影响,结果如图1所示。玉米谷蛋白DH和可溶性蛋白含量都随着反应时间的增加而增加,反应最初迅速增加,当水解时间为150 min时,玉米谷蛋白DH为(19.04±0.41)%,可溶性蛋白质量分数为(22.46±0.62)mg/L,较Zheng等[17]利用复合蛋白酶水解玉米谷蛋白在相同水解时间下蛋白DH明显提高,说明碱性蛋白酶更利于玉米谷蛋白的水解。

注:字母不同表示差异显著(P<0.05)。图1 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的水解度和可溶性蛋白含量

2.2 玉米谷蛋白及其水解物的二硫键含量、表面疏水性和热性能

大量研究发现蛋白质中二硫键含量、表面疏水性和热性能等都与蛋白质的构象和功能性质密切相关[20,21]。如表1所示,玉米谷蛋白中二硫键含量较高,说明其蛋白结构具有高度聚集性。经碱性蛋白酶水解后玉米谷蛋白水解物中二硫键含量显著降低(P<0.05),表明水解作用可以增强二硫键与巯基的活性,促进了巯基与二硫键之间的转化,导致二硫键含量的变化,进而有效降低玉米谷蛋白聚集的倾向性,有利于提高其在水中的溶解度和其他功能特性。而玉米谷蛋白水解物90 min内其表面疏水性明显高于初始的玉米谷蛋白,可能的原因是谷蛋白内部的疏水斑块由于去折叠化而暴露于分子的外表面[22],但实验过程中发现并不会产生聚集现象,且随着水解时间的增加其表面疏水性呈现降低趋势。一般而言高Tp值通常意味着高热稳定性,因此玉米谷蛋白及其水解物的高Tp值表明其都具有良好的热稳定性。另外,水解可以显著降低玉米谷蛋白的总热量焓ΔH(P<0.05),表明水解过程中蛋白质的有序结构和聚集倾向降低。

表1 玉米谷蛋白及其水解物的二硫键含量、表面疏水性和热性能

2.3 玉米谷蛋白及其水解物的溶解性

溶解性是蛋白质功能特性的重要先决条件,并直接影响其在食品工业中的应用。如图2所示,玉米谷蛋白在蒸馏水(pH 7.0)中溶解度仅为(1.99±0.28)%,可能是由于玉米谷蛋白为刚性大分子结构,含有较多的分子间和分子内二硫键和疏水相互作用力。经碱性蛋白酶水解后玉米谷蛋白水解物的溶解性显著增加(P<0.05),当水解时间为150 min时玉米谷蛋白水解物的溶解度为(97.28±0.83)%。与玉米谷蛋白相比,其水解物的溶解度提高可能归因于肽链的展开、蛋白酶水解引起的尺寸减小以及更多带电残基和极性基团的暴露等因素有关,这些结构变化改善了蛋白质与水的相互作用,从而提升了溶解性[23]。

注:字母不同表示差异显著(P<0.05),余同。图2 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的溶解性

2.4 玉米谷蛋白水解物的分子质量分布

蛋白质水解物的分子质量分布作为最重要的特性之一能直接影响其作为功能食品的应用。由于谷蛋白水解液中形成了多种类型的肽,因此肽类型的数量超出了凝胶过滤色谱柱的分辨率,因此玉米谷蛋白水解物按分子质量大小可分为:Mw>2 000 u、600 u

图3 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的分子质量分布

2.5 玉米谷蛋白及其水解物的乳化性和乳化稳定性

玉米谷蛋白及其水解物在pH 7.0时的乳化性和乳化稳定性如图4所示。玉米谷蛋白水解物的乳化性显著提升(P<0.05),均保持在较高的水平,表明水解后玉米谷蛋白的溶解度增加,使蛋白质容易扩散到油/水界面。但不同水解时间对玉米谷蛋白及其水解物的乳化稳定性变化不大,可能是水解过程中形成的可溶性聚集体可以在油水界面形成一层刚性膜,防止油滴的紧密接触,避免絮凝和聚结[24]。

图4 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的水解度乳化性/乳化稳定性

2.6 玉米谷蛋白及其水解物的起泡性和泡沫稳定性

玉米谷蛋白及其水解物在pH 7.0时的起泡性和泡沫稳定性如图5所示。玉米谷蛋白的起泡性为(83.13±8.24)%,低于大米蛋白的起泡性(118.8%)[25](P<0.05),这可能是由于玉米谷蛋白在pH 7.0的水中溶解度差。玉米谷蛋白水解物的起泡性和泡沫稳定性均显著高于玉米谷蛋白(P<0.05),可能是由于碱性蛋白酶水解能显著提高蛋白质的溶解性,降低了其分子质量和二硫键含量,从而促进了界面膜的形成和泡沫的产生。

图5 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的起泡性、泡沫稳定性

2.7 玉米谷蛋白水解物抗氧化活性

大量文献表明DPPH自由基清除率、羟自由基(·OH)清除率以及Fe2+螯合率已广泛用于评估天然化合物的抗氧化活性。由于玉米谷蛋白本身几乎不溶于蒸馏水,因此未检测其抗氧化活性。由图6可知,所有测试样品对DPPH、·OH都表现出良好的清除能力和较高的Fe2+螯合率,当水解时间为150 min时,玉米谷蛋白水解物DPPH清除率为(54.46±1.43)%,羟基自由基(·OH)清除率为(74.06±1.49)%,Fe2+螯合率为(86.69±1.35)%,均显著高于其他水解物组(P<0.05),而质量浓度为0.01mg/mL的VC组对Fe2+几乎没有螯合能力。结果表明,玉米谷蛋白水解物含有电子供体物质,可与自由基反应,将其转化为稳定产物,终止自由基连锁反应。同时,玉米谷蛋白水解物具有良好的羟清除活性,可以保护食物或生命系统免受羟自由基诱导的损伤。另外,当水解时间小于150 min时,可能是由于酸性和碱性氨基酸侧链中的羧基浓度增加导致水解物的Fe2+螯合能力增强[26]。

图6 不同水解时间玉米谷蛋白水解物的抗氧化活性

3 结论

碱性蛋白酶可有效水解玉米谷蛋白,获得具有较强抗氧化活性的玉米谷蛋白水解物,增加了其水解物的表面疏水性,降低了蛋白质的分子质量和二硫键含量,并最终在水解过程中将其不溶性天然聚集体转化为可溶性聚集体。玉米谷蛋白及其水解物都保持了较高的热稳定性。与玉米谷蛋白相比,其水解物具有更高的溶解性,改善了蛋白的起泡性和乳化性。

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