盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取丁香精油及抗氧化活性评价

黄嘉玲 胡瑜文 陆 倩 宋欠欠 李 诚 胡 滨

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

丁香（EugeniacaryophyllataThunb.）是桃金娘科植物，原产自印度尼西亚，在我国广东、广西、云南等地广泛种植。丁香干燥花蕾呈研棒状，长1～2 cm，花冠圆球形，棕褐色或褐黄色，是我国允许使用的食品香料，也可以作为中药，是天然、绿色、安全的植物［1］。丁香精油（clove essential oil，CEO）是从丁香干燥花蕾中提取的挥发性芳香物质，主要成分为丁香酚、石竹烯和乙酰基丁香酚，其中丁香酚相对含量在60%以上［2-4］，在抑菌、抗氧化、抗炎、驱虫等过程中发挥主要作用。丁香精油可以被应用于食品、农业、医药、化工等领域［5-6］。

水蒸气蒸馏、有机溶剂萃取、超临界CO2萃取、微波辅助是提取植物精油的常用方法［7-9］。其中，有机溶剂萃取可能存在溶剂残留；超临界CO2萃取成本高，对设备要求高；微波辅助提取得到的精油纯度偏低；水蒸气蒸馏法是传统的植物精油提取方法，操作简单、但提取时间较长。有研究发现，盐效应对水相萃取具有积极作用：一方面，盐效应可以破坏有机物与水之间的水合作用［10］；另一方面，盐效应可以抑制油相与水相的乳化作用［11］。潘晓梅［12］研究发现，在纯溶剂中加入盐溶液可使其沸点升高，饱和蒸汽压降低。盐效应辅助可以弥补水蒸气蒸馏法提取存在的不足，提高天然产物的提取率，但在丁香精油提取中还鲜见报道。本试验采用盐效应辅助水蒸气蒸馏提取丁香精油，并对提取工艺进行优化，通过比较丁香精油的理化指标、化学成分、结构特征、热力学性质以及抗氧化活性，探究盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取丁香精油的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丁香购自安徽亳州医珍春精品中药材公司，经粉碎过20目筛后于4 ℃保存备用。

1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐［2，2′-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS］，美国Sigma-Aldrich 公司；C7-C40 正烷烃标准溶液，上海源叶生物科技有限公司；氯化钠、无水硫酸钠、冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、过硫酸钾、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸、维生素E等，均为国产分析纯，成都化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XH-JSG 型挥发油测定器，上海那艾实验仪器设备有限公司；TE412-L型电子天平，诸暨市超泽衡器设备有限公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，上海一凯仪器设备有限责任公司；Varioskan Flash 型多功能酶标仪、Nicolet iS10型傅里叶变换红外光谱仪，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；7890A-5975C 型气相色谱-质谱联用仪，安捷伦科技（中国）有限公司；Q200M 型差示扫描量热仪，美国TA 公司；Evo18 型扫描电子显微镜（1 000×），德国卡尔·蔡司股份公司。

1.3 试验方法

1.3.1 水蒸气蒸馏法提取丁香精油 称取10.00 g丁香粉置于500 mL 圆底烧瓶，加入150 mL 蒸馏水，连接挥发油提取装置，电热套加热沸腾蒸馏5 h，记录精油体积，按公式（1）计算精油提取率。

式中，ρ为相对密度（g·mL-1）；V为精油体积（mL）；m为丁香质量（g）。

1.3.2 盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取丁香精油 称取10.00 g 丁香粉置于500 mL 圆底烧瓶，根据丁香粉质量按比例加入氯化钠溶液，连接挥发油提取装置，电热套加热沸腾后开始计时，到达设定时间后结束蒸馏，记录精油体积，按公式（1）计算精油提取率。

1.3.2.1 单因素试验 ①液料比对提取率的影响。设定NaCl浓度3%、提取时间3 h，测定不同液料比（10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1 mL·g-1）对精油提取率的影响。②NaCl 对提取率的影响。设定液料比14∶1 mL·g-1、时间3 h，测定不同NaCl浓度（2%、3%、4%、5%、6%）对精油提取率的影响。③提取时间对提取率的影响。设定液料比14∶1 mL·g-1、NaCl浓度4%，测定不同时间（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h）对精油提取率的影响。

1.3.2.2 响应面优化试验 根据单因素试验结果，选择单因素中提取率最高的及左右两侧水平，以提取率为响应值，利用Design Expert 8.0 软件设计响应面试验。

1.3.3 丁香粉末扫描电镜分析（scanning electon microscope，SEM） 参考Ding等［13］的方法，将不同处理的丁香粉末固定在导电胶上，进行喷金处理，在放大倍数1 000倍、10 kV加速电压下观察涂层样品，拍摄得到扫描电镜图。

1.3.4 丁香精油品质评价

1.3.4.1 丁香精油理化指标测定 参考GB/T 14454.1-2008《香料 试样制备》［14］、GB/T 11540-2008《香料 相对密度的测定》［15］、GB/T 14455.6-2008《香料 酯值或含酯量的测定》［16］、GB/T 33918-2017《香料 过氧化值的测定》［17］、GB/T 14455.5-2008《香料 酸值或含酸量的测定》［18］，分别测定水蒸气蒸馏、盐效应辅助水蒸气蒸馏提取两种方法提取的丁香精油的相对密度、酯值、过氧化值和酸值。

1.3.4.2 气相色谱-质谱联用分析（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS） 参考Wang 等［19］的方法并稍作修改。色谱条件：（HP-5MS）（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷毛细管柱（30 m ×250 μm×0.25 μm），以He为载气，流速1 mL·min-1，初始温度50 ℃保持2 min，以3 ℃·min-1升温至140 ℃，再以8 ℃·min-1升温至220 ℃保持3 min。进样口温度230 ℃，检测器温度280 ℃，分流比20∶1，进样量1 μL。质谱条件：电离方式方面，电子电离源（electron ionization，EI）电离电压70 eV，离子源温度260 ℃，40～800 amu 全扫描。在与样品相同的试验条件下，用标准的正构烷烃（C7-C40）计算化学成分的保留指数（retention indices，RI）。将化合物的RI 值与文献值比较，质谱与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）文库数据［20］比较。对于色谱图上的每个组分，计算其峰面积占所有组分总面积的百分比，并表示为该组分的相对含量。

1.3.4.3 差示扫描量热分析（differential scanning calorimetry，DSC） 参考Semcheddine 等［21］的方法并稍作修改，称取适量样品放入铝坩埚，盖上坩埚盖，放入样品室，以空坩埚作空白对照，设置氮气流速50 mL·min-1，初始温度20 ℃，以20 ℃·min-1升温至400 ℃。

1.3.4.4 傅里叶变换红外光谱分析（fouriertransform infrared spectoscopy，FTIR） 利用衰减全反射模式测试丁香精油的红外光谱图，选择硒化锌作为窗口，设置自动增逸，扫描次数32次，分辨率4 cm-1，室内空气作背景。

1.3.5 丁香精油抗氧化活性测定

1.3.5.1 ABTS自由基清除能力测定 参考Yang等［22］的方法并稍作修改：7 mmol·L-1ABTS与2.45 mmol·L-1过硫酸钾溶液等体积混合，在室温避光条件下静置过夜，无水乙醇稀释至溶液在734 nm 处吸光度值为0.7。配制系列浓度的丁香精油-无水乙醇溶液，向96孔板中分别加入丁香精油-无水乙醇溶液和ABTS自由基工作液，于734 nm处测定，以同浓度维生素E作阳性对照。

式中，A为5 μL 无水乙醇+195 μL ABTS 自由基工作液的吸光度值；B为5 μL 丁香精油-无水乙醇溶液+195 μL ABTS自由基工作液的吸光度值。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力测定 参考Wu等［23］的方法并稍作修改：避光条件下配制0.01 mol·L-1DPPH自由基溶液，配制系列浓度的丁香精油-无水乙醇溶液，对应溶液加入96 孔板，室温避光反应30 min，于517 nm处测定，以同浓度维生素E作阳性对照。

式中，A为5 μL丁香精油-无水乙醇溶液+195 μL DPPH自由基工作液的吸光度值；B为5 μL无水乙醇+195 μL DPPH 自由基工作液的吸光度值；C为5 μL 丁香精油-无水乙醇溶液+195 μL无水乙醇的吸光度值。

1.3.5.3 羟自由基清除能力测定 参考康荷笛等［24］的方法并稍作修改：配制9 mmol·L-1FeSO4溶液、8.8 mmol·L-1过氧化氢溶液、9 mmol·L-1水杨酸和系列浓度的丁香精油-无水乙醇溶液备用。向96 孔板中加入相应溶液，37 ℃水浴反应30 min，于510 nm 处测定，同浓度维生素E作阳性对照。

式中，A为丁香精油-无水乙醇溶液+FeSO4+H2O2+水杨酸（各100 μL）的吸光度值；B为无水乙醇+FeSO4+H2O2+水杨酸（各100 μL）的吸光度值；C为丁香精油-无水乙醇溶液+FeSO4+蒸馏水+水杨酸（各100 μL）的吸光度值。

1.4 数据处理

采用Design Expert 8.0 软件进行响应面试验设计和分析，采用OringinPro 2021 软件绘图，采用SPSS 27软件进行显著性分析，所有试验均重复3次，试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 液料比对精油提取率的影响 由图1-A可知，随着液料比增加，提取率先上升后下降。液料比过低时，盐溶液不能与丁香粉末充分接触，不利于分子扩散而导致提取率偏低；液料比过高时，丁香精油提取率反而降低，可能是由于盐溶液过多，发生乳化现象，抑制了丁香精油与盐溶液分离。因此，选择液料比14∶1 mL·g-1为中值进行响应面试验。

图1 液料比（A）、氯化钠浓度（B）和提取时间（C）对丁香精油提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-solid ratio （A），NaCl concentration （B） and extraction time （C） on the extraction rate of CEO

2.1.2 氯化钠浓度对精油提取率的影响 由图1-B可知，随着NaCl 浓度增加，提取率先升高后降低。可能是因为少量NaCl 可以调节丁香原料组织细胞内外渗透压，促进丁香精油溶出，同时引起水溶液饱和蒸汽压下降，沸点升高，加快精油提取效率；而过量的NaCl使溶液沸点过高导致丁香精油中挥发性成分损失。因此，选择NaCl浓度4%为中值进行响应面试验。

2.1.3 提取时间对精油提取率的影响 由图1-C可知，随着提取时间延长，提取率先逐渐提高后降低，蒸馏至4.0 h时提取率最高，然后继续加热提取率反而降低，可能是因为精油中有效成分被过度加热后发生挥发损失。因此，选择提取时间4.0 h为中值进行响应面试验。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面模型的建立 响应面试验设计及结果见表1。通过Design Expert 8.0 软件对数据进行拟合分析，得到提取率（extraction ratio，Y）与液料比（liquid-solid ratio，A）、NaCl 浓度（NaCl concentration，B）、提取时间（extraction time，C）的二次回归方程模型：

表1 响应面试验设计及结果Table 1 Experimental design and results of response surface methodology

2.2.2 响应面模型的显著性检验 回归模型的方差分析及显著性结果见表2。该模型中F值为224.03，P＜0.000 1，表明该模型具有极显著性；R2=0.996 5，R2

adj=0.992 1，R2pred=0.962 9，均接近1；变异系数（coefficient of variance，CV）=0.40%，失拟项不显著，表明模型与实际拟合较好。对回归方程系数进行显著性检验可知，A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2对试验结果影响显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01），说明试验各因素对响应面的影响是二次抛物线关系，存在最大值。因此，该模型用于丁香精油提取率的预测具有可行性。

2.2.3 各因素间交互作用 任意两因素交互作用对丁香精油提取率影响的响应面见图2。由图2-A 可知，随着液料比与NaCl浓度增加，提取率增加；但当提取率增加到一定幅度后，随着液料比与NaCl 浓度增加，提取率反而下降。这是由于NaCl 浓度增加有助于分子运动加快，同时料液比增加有利于NaCl 溶液与原料的接触面积增大，这些都有利于提取的进行。但当液料比过大时，溶解在NaCl 溶液中的精油浓度下降，导致提取率降低。由图2-B 可知，随着液料比与提取时间增加，提取率增加；但当提取率增加到一定幅度后，随着液料比与提取时间增加，提取率降低。这是由于随着液料比和提取时间延长，有利于提取充分进行，但过长的提取时间会导致精油发生挥发损失。由图2-C 可知，随着NaCl 浓度与提取时间增加，提取率先增加后下降。这是由于在保证充足提取时间前提下，增加NaCl 浓度促进分子运动加快，提取率增加；但提取时间过长时，反复的水蒸气蒸馏会使已经被提取出来的精油发生挥发损失，导致提取率降低；此外，过长的提取时间还会增加能耗。

图2 两因素交互作用对丁香精油提取率影响的响应面图Fig.2 Response surface plots of the interaction of two factors on the extraction rate of CEO

2.2.4 验证试验结果 采用Design-expert 8.0 软件对回归方程模型进行预测，预测的最佳工艺为液料比13.23∶1 mL·g-1、氯化钠浓度3.75%、提取时间3.97 h，理论提取率为18.67%。为了方便操作，将工艺调整为液料比13.20∶1 mL·g-1、氯化钠浓度3.70%、提取时间4.0 h，提取率为18.56%，实际值与理论值接近，说明此回归模型真实可靠。

2.3 两种方法提取丁香精油的提取率比较

两种方法提取丁香精油的提取率见表3。使用盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取丁香精油，不仅可以有效缩短提取时间，还能提高提取率、有效节约能源、提高丁香利用率。

表3 两种方法提取丁香精油的提取率Table 3 Extraction rate of CEO from two methods

2.4 两种提取方法对丁香原料微观结构的影响

图3 展示了经过不同程度处理的丁香粉末在电镜扫描下的微观结构。未经处理的丁香粉末结构完整，表面光滑；水蒸气蒸馏处理和盐效应辅助水蒸气蒸馏处理的丁香粉末表面结构受到严重破坏，二者均出现许多不规则的孔洞结构，被破坏程度相当。其中，水蒸气蒸馏处理经过5.0 h提取，而盐效应辅助水蒸气蒸馏处理只经过4.0 h提取，盐效应辅助水蒸气蒸馏法可使丁香粉末在更短的时间内达到充分的破裂，这可能是因为盐的加入加快了分子运动，更容易引起丁香细胞壁破裂，促使细胞中挥发性成分快速溶出，最终在更短时间内提取到更多的丁香精油。

图3 丁香原料的电镜扫描观察Fig.3 Scanning electron microscope observation of clove powder

2.5 两种方法提取丁香精油的理化特性分析

两种不同方法提取丁香精油的理化特性见表4。水蒸气蒸馏法和盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取得到的丁香精油颜色均为透明的淡黄色，具有强烈的丁香香味，感官品质好；在20 ℃时的相对密度均为1.05 g·mL-1，略高于水的密度，与提取过程中丁香精油在水中下沉的现象一致；两种方法提取的丁香精油酸值分别为0.83 和0.84 mg KOH·g-1，均小于1 mg KOH·g-1，说明丁香精油质量较好；丁香精油被氧化程度与过氧化值大小呈正相关，本试验制备的丁香精油过氧化值均低于0.1 mmol·kg-1，说明品质较好，这可能与其良好的抗氧化活性有关；皂化值是精油质量的综合评价指标，两种方法提取的丁香精油皂化值分别为9.07 和9.12 mg KOH·g-1，二者差异不大，说明盐效应辅助水蒸气蒸馏法不会对丁香精油成分和结构产生影响。

表4 两种方法提取的丁香精油的理化特性Table 4 Physicochemical properties of CEO extracted by two methods

2.6 两种方法提取丁香精油的GC-MS分析

用峰面积归一化法计算精油组分的质量分数，通过NIST 图谱库检索以及查阅相关文献确认丁香精油成分，结果见表5。不同方法提取的丁香精油均有8种化学物质，占色谱总流出峰的99.80%和99.06%，不同方法提取的丁香精油的主要成分均为丁香酚、乙酰基丁香酚和石竹烯，且相对含量差异不大。对比发现，不同方法提取的丁香精油成分无明显差异，说明盐效应辅助水蒸气蒸馏不会对丁香精油主要成分产生影响。

表5 两种方法提取丁香精油成分分析Table 5 Composition analysis of CEO extracted by two methods

2.7 两种方法提取丁香精油的DSC分析

DSC 曲线见图4。两钟方法提取丁香精油DSC 曲线图峰型一致，均在280 ℃出现吸热峰，这是丁香精油中挥发性物质吸热汽化所致。二者无明显差异，说明盐效应辅助水蒸气蒸馏法不会改变丁香精油的热稳定性。

图4 水蒸气蒸馏（A）和盐效应辅助水蒸气蒸馏（B）提取丁香精油DSC曲线Fig.4 DSC analysis of CEO from （A） steam distillation and （B） salt effect assisted steam distillation

2.8 两种方法提取丁香精油的FTIR分析

由图5可知，两种方法提取丁香精油的红外光谱图曲线峰形基本一致，均出现了大量吸收峰，表明丁香精油中含有多种挥发性化合物，其中3 076 和3 059 cm-1为C－H不对称伸缩振动吸收峰，2 842和2 841 cm-1为C－H 对称伸缩振动吸收峰，1 763 cm-1为酰胺Ⅰ带的C＝O 伸缩振动吸收峰，1 513 和1 510 cm-1为芳香族C＝C 伸缩振动吸收峰。不同方法提取的丁香精油无明显差异，说明盐效应辅助水蒸气蒸馏不会改变丁香精油中主要官能团结构。

图5 水蒸气蒸馏（A）和盐效应辅助水蒸气蒸馏（B）提取丁香精油FTIR分析Fig.5 FTIR analysis of CEO from （A） steam distillation and （B） salt effect assisted steam distillation

2.9 两种方法提取丁香精油的抗氧化活性分析

2.9.1 ABTS 自由基清除能力 ABTS 自由基的清除机理是基于氢原子转移（hydrogen atom transfer，HAT），被氧化的ABTS在734 nm处具有特征吸收，向其中加入丁香精油可使反应体系褪色、吸光度降低［25］。由图6-A可知，在一定范围内，丁香精油浓度越大，对ABTS 自由基的清除效果越好，越来越接近同浓度维生素E。有研究表明，ABTS自由基清除率可能与丁香精油中酚羟基含量有关［26］。本研究发现，精油中的丁香酚含量随丁香精油浓度的增加而增加，因此表现出更好的清除能力，且不同方法提取的丁香精油ABTS 自由基的清除效果无明显差异。

图6 两种方法提取丁香精油清除ABTS自由基（A）、DPPH自由基（B）和羟基自由基（C）能力Fig.6 Capabilities of two methods of extracting CEO for scavenging ABTS radical（A），DPPH radical （B） and hydroxyl radical （C）

2.9.2 DPPH 自由基清除能力 DPPH 自由基的清除主要依赖HAT和单电子转移（single electron transfer，SET），物质的含氢能力强弱直接影响其DPPH 自由基清除能力［27］。由图6-B 可知，DPPH 自由基清除率随精油浓度的增大而增加，增幅先大后小，逐渐接近同浓度维生素E。可能是由于丁香精油中含有大量丁香酚，丁香酚的酚羟基与DPPH 自由基反应生成苯氧基自由基，精油浓度较小时酚羟基数量较少，所以DPPH 自由基清除效果有限，随着浓度增加，酚羟基数量增加，更多DPPH 自由基被清除，表现出更好的清除效果，且不同提取方法对丁香精油的DPPH 自由基清除能力无明显影响。

2.9.3 羟基自由基清除能力 羟基自由基与水杨酸反应生成的有色化合物在510 nm 处有特征吸收，向体系中加入抗氧化剂可以抑制羟基自由基与水杨酸反应，使体系在510 nm处的吸光度降低。由图6-C可知，丁香精油的羟基自由基清除能力随浓度升高而加强，这是由于丁香酚羟基上的氢比较活泼，浓度越高，可使更多氢与羟基结合，即有更多的羟基自由基被清除［28］。两种丁香精油的曲线基本重合，说明不同方法提取的丁香精油对羟基自由基的清除能力无明显差异。

3 讨论

尹团章等［29］用水蒸气蒸馏法的改良工艺提取不同产地的丁香精油，提取率分别为14.12%、13.43%和12.56%，说明丁香精油的提取率与原料产地相关。本试验分别用水蒸气蒸馏法和盐效应辅助水蒸气蒸馏法处理同一批丁香原料，提取率从14.77%提高到18.56%，说明盐效应辅助对于丁香精油提取具有促进作用；马钤等［30］利用盐析辅助提取甘松精油也展现出积极影响，可能是由于NaCl 增加了原料组织细胞内外渗透压，更有利于油类成分渗出。无机盐与水蒸气蒸馏法联用不仅保留了水蒸气蒸馏法设备简单、操作方便、成本低廉的特点，同时也克服了提取率低的问题。后续试验可研究不同种类无机盐对精油提取的影响。

付振喜［31］用超声波法和索式提取法提取丁香精油，分别得到22 和12 种化学组分，主要成分与本试验结果一致，均为丁香酚、石竹烯、乙酰基丁香酚，但相对含量略有差异，可能与原料的品种、产地、气候等多种因素有关［32］。不同方法提取的丁香精油均呈透明的淡黄色，通过理化指标、DSC、FTIR 测定得知精油质量良好，且热稳定性和官能团结构未发生变化。

丁香精油抗氧化能力略低于维生素E，随着浓度升高，丁香精油对ABTS 自由基、DPPH 自由基、羟基自由基的清除能力逐渐提高，逐渐接近同浓度维生素E，说明丁香精油在抗氧化方面具有较大利用价值。Ma 等［33］研究表明，酚类化合物具有抗氧化性是由于酚羟基具有供氢和供电子的能力，酚羟基含量直接影响其抗氧化活性。丁香精油的主要成分为丁香酚，也是丁香精油具有抗氧化活性的最主要因素，浓度越高，酚羟基含量越高，抗氧化能力越强，Tsantili 等［34］的试验也得到同样的结果。不同方法提取的丁香精油中丁香酚含量差异不大，因此抗氧化能力也无明显差异。关于丁香酚的抗氧化机理还有待进一步研究。

4 结论

本研究通过盐效应辅助水蒸气蒸馏法提取丁香精油获得的最佳工艺条件为液料比13.20∶1 mL·g-1、NaCl 浓度3.70%、提取时间4.0 h，提取率达18.56%，比水蒸气蒸馏法提高3.79 个百分点。通过成分分析、理化指标、热稳定性及抗氧化活性研究发现，两种方法提取的丁香精油无明显差异，说明盐效应辅助提取可有效提高丁香精油提取率，且不会对精油品质造成不良影响，可以用于丁香精油的提取研究。