circLRP6靶向miR-2116-3p促进皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖、迁移和侵袭的机制

李静 柯锦 严伟华

(1武汉市第九医院皮肤科,湖北 武汉 430081;2上海市浦东医院皮肤科)

皮肤鳞状细胞癌具有高度侵袭性,其治疗以手术为主,放化疗为辅〔1〕。目前,皮肤鳞状细胞癌发病机制尚未明确,探究其发生发展的分子机制可为其治疗提供新靶点。环状RNA(circRNA)低密度脂蛋白受体相关蛋白(circLRP)6是脂蛋白受体相关蛋白6基因的转录产物,属于环状RNA(circRNA)。Zhang等〔2〕研究显示,circLRP6在口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织中呈高表达,下调circLRP6可抑制OSCC细胞上皮间质转化(EMT)过程;Qin等〔3〕研究显示,circLRP6可海绵吸附miR-330-5p提高核受体结合蛋白(NRBP)1表达进而促进前列腺癌细胞生长和转移。然而,目前尚不清楚circLRP6对皮肤鳞状细胞癌进展的影响。StarBase软件预测显示,miR-2116-3p可能是circLRP6的靶基因。miR-2116-3p可靶向抑制Piwi样RNA介导基因沉默(PIWIL1)表达阻碍结直肠癌的发展进程〔4〕。但是,miR-2116-3p能否影响皮肤鳞状细胞癌的发生发展也还未知。本研究探究circLRP6和miR-2116-3p对皮肤鳞状细胞生物学行为的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 于2018年5月至2020年9月收集在武汉市第九医院行手术治疗的皮肤鳞状细胞癌患者(39例)的癌组织及癌旁组织,液氮保存。男20例,女19例,平均年龄(46.28±7.41)岁。纳入标准:首次确诊;术前未进行放、化疗等治疗。所有患者签订知情同意书,研究经武汉市第九医院伦理委员会审核批准(批准号201803009)。

1.2细胞和主要试剂 A431细胞系,中国科学院上海细胞库;聚合酶链反应(PCR)实验相关试剂(大连宝生物);胎牛血清(浙江天杭);circLRP6小干扰RNA(si-circLRP6)、miR-2116-3p模拟物(mimcs)/抑制剂(anti-miR-2116-3p)及阴性对照(si-NC、miR-NC/anti-miR-NC)、circLRP6野生型(WT)-circLRP6和突变型(MUT)-circLRP6载体、引物序列(上海生工);MMP-2和MMP-9抗体(英国Abcam公司)。

1.3实时荧光定量(qRT)-PCR法检测circLRP6和miR-2116-3p表达 提取组织总RNA,反转录为cDNA后,行PCR扩增。2-△△Ct法计算circLRP6、miR-2116-3p相对表达量。引物序列:circLRP6:上游5′-GAGTTGGATCAACCCAGAGC-3′、下游5′-TCCTCCAAGCCTCCAACTAC-3′,GAPDH:上游5′-CCCACATGGCCTCCAAGGAGTA-3′、下游5′-GTGTACATGGCAACTGTGAGGAGG-3′,miR-2116-3p:上游5′-AATCCTATGCCAAGAACTCCC-3′、下游5′-CT-CTACAGCTATATTGCCAGCCA-3′,U6:上游5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′、下游5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.4A431细胞培养和转染 用RPMI1640培养液(含10 %胎牛血清的完全培养液)在CO2培养箱中培养A431细胞。取6孔板,加2.5 ml A431细胞悬液(5.0×104个/ml),分为si-circLRP6组、si-NC组、miR-2116-3p组、miR-NC组、si-circLRP6+anti-miR-2116-3p组、si-circLRP6+anti-miR-NC组。转染24 h后,收集各组细胞备用。

1.5CCK-8检测A431细胞增殖活性 将1.4中各组细胞悬液(5.0×104个/ml)加入96孔板,每孔200 μl,24 h后,加CCK-8 10 μl,反应2 h后检测450 nm处光密度(OD450 nm)值。

1.6克隆形成实验 6孔板中接种转染后的各组细胞,经14 d培养、固定、结晶紫染色后,计数克隆数。

1.7划痕实验 于6孔板接种各组细胞,培养24 h,枪头垂直于孔底划线,测量划痕宽度(0 h)。继续培养24 h,再次测量(24 h),计算划痕愈合率〔(1-24 h/0 h)×100%〕。

1.8Transwell实验 将各组细胞重悬(5.0×104个/ml),取100 μl悬液加入上室(预铺Matrigel),另取500 μl培养液(含血清)添加至下室。24 h将细胞固定、结晶紫染色。显微镜下计数。

1.9Western印迹法测MMP-2、MMP-9蛋白表达 提取细胞总蛋白,定量蛋白浓度后,将蛋白样本进行凝胶电泳分离并转膜,将膜封闭1 h后,4 ℃下与一抗MMP-2、MMP-9、GAPDH(均1∶1 000)孵育24 h,再与二抗(1∶2 000)室温孵育1 h。显影、曝光,分析蛋白表达。

1.10双荧光素酶实验 于6孔板中接种A431细胞,共转染WT-circLRP6(或MUT-circLRP6)与miR-2116-3p mimics(或miR-NC)。转染24 h后,检测荧光素酶活性。

1.11统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1皮肤鳞状细胞癌组织中circLRP6和miR-2116-3p表达 皮肤鳞状细胞癌组织中circLRP6表达量明显高于癌旁组织(4.30±0.41 vs 1.00±0.07;t=49.548,P<0.05),miR-2116-3p表达量(0.30±0.04)明显低于癌旁组织(1.00±0.06;t=60.622,P<0.05)。

2.2下调circLRP6对A431细胞表型的影响 si-circLRP6组A431细胞中circLRP6表达量(0.29±0.03)显著低于si-NC组(1.00±0.00;t=59.000,P<0.05)。si-circLRP6组细胞增殖、克隆形成数、迁移、侵袭能力和MMP-2、MMP-9蛋白水平较si-NC组明显下降(P<0.05)。见图1、图2、表1、图3。

2.3过表达miR-2116-3p对A431细胞生物学行为的影响 与miR-NC组(1.00±0.00)相比,miR-2116-3p组miR-2116-3p表达量(2.55±0.22)明显升高(t=21.136,P<0.05)。miR-2116-3p组细胞增殖、克隆形成数、迁移、侵袭能力和MMP-2、MMP-9蛋白较miR-NC组明显下降(P<0.05)。见图1、图2、表1、图3。

2.4抑制miR-2116-3p逆转敲低circLRP6对A431细胞的作用 si-circLRP6+anti-miR-2116-3p组miR-2116-3p表达量较si-circLRP6+anti-miR-NC组明显降低(0.43±0.04 vs 1.00±0.00;t=42.750,P<0.05)。si-circLRP6+anti-miR-2116-3p组细胞增殖、克隆形成数、迁移、侵袭能力和MMP-2、MMP-9蛋白水平较si-circLRP6+anti-miR-NC组明显上调(P<0.05)。见图1、图2、表1、图3。

图1 各组细胞克隆数(结晶紫染色)

图2 各组细胞迁移(×100)、侵袭(结晶紫染色,×200)

表1 各组A431细胞增殖、克隆形成数、迁移、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9表达比较

2.5circLRP6靶向调控miR-2116-3p StarBase数据库分析发现circLRP6与miR-2116-3p有结合位点,见图4。WT-circLRP6+miR-2116-3p mimics组荧光素酶活性明显低于WT-circLRP6+miR-NC组(0.53±0.05 vs 1.02±0.06;t=18.821,P<0.05);MUT-circLRP6+miR-2116-3p mimics组与MUT-circLRP6+miR-NC组荧光素酶活性无明显差异(1.00±0.06 vs 1.03±0.08;t=0.900,P=0.381)。此外,si-circLRP6组miR-2116-3p表达量较si-NC组明显升高(2.83±0.24 vs 1.00±0.00;t=22.875,P<0.05)。

1～6:si-NC组、si-circLRP6组、miR-NC组、miR-2116-3p组、si-circLRP6+anti-miR-NC组、si-circLRP6+anti-miR-2116-3p组图3 Western印迹检测各组MMP-2和MMP-9蛋白表达

图4 circLRP6与miR-2116-3p结合位点

3 讨 论

circRNA是一种非编码RNA,呈闭合环状结构,具有良好的稳定性。随着对circRNA研究的深入,发现circRNA在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中呈异常表达,并参与癌症进展〔5～7〕。文献表明,多种circRNA参与皮肤鳞状细胞癌的发展进程。例如,circ_001937、circ_0067772、circ RNA核糖核蛋白(circ-LARP)1B在皮肤鳞状细胞癌中表达增加,可分别靶向miR-597-3p/FOS样抗原(FOSL)2、miR-1238-3p/叉头框蛋白(FOX)G1、miR-515-5p/爪蟾驱动蛋白样蛋白2靶蛋白(TPX2)轴促进皮肤鳞状细胞癌的发展进程,为该肿瘤的治疗提供了分子靶点〔8～10〕。

研究表明,circLRP6在骨肉瘤组织中表达增加,敲减circLRP6抑制了骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,circLRP6作为致癌基因促进骨肉瘤的发展进程〔11〕;circLRP6在食管鳞癌(ESCC)组织中表达上调,敲减circLRP6可通过靶向miR-182/Myc轴降低ESCC细胞的活力、集落形成和侵袭,circLRP6可作为ESCC治疗的分子靶点〔12,13〕。本研究提示,下调circLRP6可抑制皮肤鳞状细胞癌细胞恶性表型。

研究显示,miR-2116-3p可靶向抑制Myc抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移能力及上皮间质转化,并诱导细胞凋亡,miR-2116-3p在乳腺癌中起抑癌基因作用〔14〕。本研究结果表明,miR-2116-3p可作为皮肤鳞状细胞癌的抑癌基因。此外,敲低circLRP6可升高miR-2116-3p表达,双荧光酶实验证实circLRP6与miR-2116-3p存在靶向关系;下调miR-2116-3p逆转了敲低circLRP6对A431细胞的影响,这提示circLRP6通过竞争性吸附miR-2116-3p来影响皮肤鳞状细胞癌进展。

综上,circLRP6可能通过竞争性吸附miR-2116-3p来影响皮肤鳞状细胞癌细胞的恶性行为。但circLRP6/miR-2116-3p的下游靶基因仍需进一步分析,且尚需体内实验对circLRP6/miR-2116-3p调控网络进行验证。