电针治疗对脊髓损伤大鼠模型神经功能的影响及作用机制

谭培勇 胡广

(贵州中医药大学第一附属医院骨科,贵州 贵阳 550002)

脊髓损伤是由脊柱骨折后脊椎移位或者是碎骨片突出所导致,其原因多为直接暴力、间接暴力导致〔1,2〕。有研究发现,脊髓损伤与神经营养因子(NT)和脊髓改善紧密相关〔3〕。另有研究表明,电针是中医药领域的治疗方法,可促进受损脊髓分泌内源性NT,可使脊髓功能恢复〔4〕。脑源性NT(BDNF)可以促进损伤神经元修复,利于神经环路重建〔5〕。NT-3广泛存在神经系统内,具有调控神经发育的作用〔6〕。本研究探究电针治疗对脊髓损伤大鼠模型神经功能的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1研究动物 选取50只大鼠随机分为空白对照组10只、其余40只大鼠参照白春宏等〔7〕研究建立脊髓损伤模型作为脊髓损伤模型组,空白对照组给予普通饲料正常喂养,不进行针药处理,脊髓损伤模型组给予高脂饲料(脂肪30%,蛋白质20%,碳水化合物50%)喂养,不施加针药影响,喂养1 w后每组随机抽样2只,取脊髓组织苏木素-伊红(HE)染色,发现脊髓组织神经元缺失,结构不清晰为建模成功。建模成功后将脊髓损伤模型组38只大鼠分为模型组(13只)、甲泼尼松龙组(12只)、电针组(13只)。

1.2给药干预 给予上述处理1 w后,于第2周开始给药。甲泼尼松龙组给予甲泼尼松龙药液灌胃,2次/d,2 ml/次。电针组给予电针治疗,取相当于人体的“大椎”“命门”、与损伤平面上下棘突旁的“夹脊穴”垂直进针4～5 mm,电流强度为1～3 mA,频率2 Hz,连续波,1次/d,20 min/次,以上各组均连续治疗1 w。

1.3病理形态学观察 采血后取脊髓组织进行脱水、透明、包埋、制备横切面石蜡切片,做HE染色,观察光镜下脊髓组织的病理变化。

1.4BDNF、NT-3 取大鼠脊髓组织,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测BDNF、NT-3,石蜡组织切片脱蜡至水、修复、冷却;经过磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后,采用30%的Triton X-100溶液浸泡10 min,室温封闭1 h,加入(1∶200)的BDNF、NT-3,4 ℃过夜,PBS洗涤后避光加入Alexa Fluor488荧光二抗,37 ℃孵育1 h,PBS洗涤,显微镜下观察,采用ImageJ软件识别视野中的BDNF、NT-3阳性细胞数,试剂由Abcam提供(批号:ab108319、ab7484)重复实验5次。以GAPDH为内参照,定量分析蛋白表达情况。采用2-△△Ct方法计算出BDNF表达量,BDNF上游引物:5′-GGACCCTGAGTTCCACCA-3′,下游:5′-CAAAAGTGTCAGCCAGGGA-3′;NT-3上游引物:5′-GCGAGACTGAATGACCGAACT-3′,下游:5′-GCCA-CGGAGATAAGCAAGAAA-3′。内参GAPDH上游引物:5′-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3′,下游:5′-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3′。

1.5脊髓损伤的行为学评分(BBB) 采用BBB〔8〕评价大鼠后肢功能情况,由熟悉本实验评分标准的人员进行评价,至少两人,每组动物于造模后每天一次评分,评分观察期4 min,每只动物取两后肢平均值。

1.6丝裂原激活细胞外信号调节激酶(MEK)2、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(P-ERK)1 通过Western印迹对脊髓组织中的MEK2/P-ERK1信号通路蛋白MEK2、P-ERK1表达量进行检测,取受损脊髓组织研磨,取蛋白,采用Bradford法检测蛋白含量,经过凝胶电泳分离,将蛋白移至聚偏氟乙烯(PVDF)印迹膜上。加入5%TBS-T脱脂奶粉封闭,加入适当的抗体,4 ℃过夜,洗膜3次,每次10 min,将PVDF膜放置电化学发光(ECL)混合液孵育5 min,用IPP软件对扫描蛋白图像进行分析,重复实验5次。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析,两组间比较采用t检验。

2 结 果

2.1脊髓损伤模型判定 造模后病理切片显示,空白对照组脊髓神经元形态结构清晰、排列紧密;脊髓损伤模型组脊髓神经元缺失较为明显,结构不清晰。见图1。

图1 两组脊髓形态病理切片(HE染色,×200)

2.2病理特征比较 空白对照组脊髓神经元形态结构清晰、排列紧密;模型组脊髓神经元缺失明显,结构不清晰;甲泼尼松龙组脊髓神经元数目比模型组增多,结构较为清晰;电针组神经元排列整齐,结构清晰。见图2。

图2 各组脊髓形态病理特征比较(HE染色,×400)

2.3各组脊髓组织MEK2、P-ERK1相对蛋白表达量对比 与空白对照组相比,模型组、甲泼尼松龙组、电针组MEK2、P-ERK1明显降低(P<0.05);与模型组相比,甲泼尼松龙组、电针组MEK2、P-ERK1明显升高(P<0.05);与甲泼尼松龙组相比,电针组MEK2、P-ERK1明显升高(P<0.05)。见图3、表1。

2.4各组BDNF、NT-3阳性细胞数比较 与空白对照组相比,模型组、甲泼尼松龙组、电针组BDNF、NT-3阳性细胞数明显降低(P<0.05);与模型组相比,甲泼尼松龙组、电针组BDNF、NT-3阳性细胞数明显升高(P<0.05);与甲泼尼松龙组相比,电针组BDNF、NT-3阳性细胞数明显升高(P<0.05)。见表1。

2.5各组BBB比较 与空白对照组相比,模型组、甲泼尼松龙组、电针组BBB明显降低(P<0.05);与模型组相比,甲泼尼松龙组、电针组BBB明显升高(P<0.05);与甲泼尼松龙组相比,电针组BBB明显升高(P<0.05)。见表1。

1～4:空白对照组、模型组、甲泼尼松龙组、电针组图3 Western印迹检测各组脊髓组织MEK2/P-ERK1通路蛋白表达

表1 各组BDNF、NT-3阳性细胞数、BBB、MEK2、P-ERK1蛋白表达比较

3 讨 论

脊髓和脑组织一样有可塑性,脊髓损伤临床主要症状有肢体运动、大小便功能障碍等〔9,10〕。全球发病率较高,致残率较高,发病突然,严重威胁患者的生命健康。脊髓损伤在中医学属于外伤淤血导致“痿证”“腰痛”等范畴〔11〕。

脊髓损伤后气血亏虚、经脉阻滞、肌肉痿废,与“痿证”相契合,“痿证”指肢体筋脉弛缓,软弱无力的一种病症〔12〕。其病因不外乎两种,外伤者与外力撞击者导致经络血脉离断,如《血证论》曰:“痿者,足废不能行之谓”。电针是中医药领域中的重要方法,可用于脊髓损伤的治疗,从穴位角度而言,每个穴位都是从浅到深,会涉及皮肤、血管等,会伴有相应的神经系统。电针是在普通针柄处连接电针治疗仪,将电刺激与针刺结合增加刺激的力度,电针对中枢神经系统有保护作用,可以修复受损神经,且电针形成的电磁场又可强化夹脊针的作用〔13,14〕。

NT在体内和离体时均可维持损伤脊髓神经细胞。BDNF有促进神经元修复的作用,是迄今发现的最强NT,可增加维持损伤部位细胞的存活〔15〕。NT-3分布于脊髓、背根节、大脑皮质、海马等区域,可以和单跨膜细胞表面糖基化受体相结合成原肌球蛋白受体激酶(Trk)C,通过其发挥生物学效应〔16〕。有研究表明,脊髓中TrkC过表达能提高神经前体细胞存活率〔17〕。本研究结果提示,电针可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能、运动功能恢复。

细胞外信号通路系统在脊髓损伤中有关键作用,ERK是MAPK超家族中的一员,MEK/ERK信号通路是将细胞外刺激信号传导至细胞的重要通路,活化MEK可以激活ERK,ERK是MEK磷酸化的触点,参与了多种疾病〔18〕。ERK是一种Ser/Thr蛋白激酶,位于胞质中,激活后转移至胞核,ERK1可以增强依赖ERK2信号,促进细胞的增殖,ERK1/2活化有促进神经再生的作用〔19〕。MEK2、P-ERK1在促进细胞增殖中起重要作用,参与了脊髓损伤修复的过程〔20,21〕。本研究结果表明,MEK2/P-ERK1信号通路与脊髓损伤的发展密切相关,但目前未有研究将其用于脊髓损伤的研究中,因此上述研究需后续研究进一步分析验证。

综上,脊髓损伤发生后伴随着神经功能损伤、肢体运动障碍等现象,经过电针治疗后可以促进脊髓损伤大鼠的神经功能、运动功能恢复,其机制可能与MEK2/P-ERK1信号通路被抑制有关。