miR-541-5p在食管癌组织中表达及调控DDX52表达对食管癌细胞增殖、迁移的影响

杨海龙 王丁丁 陈雨桐 陈晓伟 李冰 王欣丽

(哈励逊国际和平医院 1胸外科,河北 衡水 053000;2神经内一科)

食管癌(EC)被认为是全球最主要的恶性肿瘤之一,也是中国男性癌症相关死亡的主要原因之一,每年有近214 090例EC新病例被诊断出来,大约197 823人死亡〔1〕。目前,EC有多种诊断和治疗策略,包括色素内镜检查、窄带成像和可疑病变活检。虽然先进的技术在一定程度上提高了EC的治疗效率,但EC的预后仍然很差,提示EC仍然是我国首要的公共卫生问题〔2,3〕。因此,有必要探索新的方法以提高EC的诊断和预后。

miRNA是一种小型的非编码RNA,在转录后水平参与基因调控。据报道,miRNA的失调通过调节与肿瘤发生过程相关的靶基因参与癌变过程〔4,5〕。例如,miR-154-5p在肿瘤组织中低表达,并抑制乳腺癌细胞增殖和转移〔5〕。越来越多的证据也表明,miRNA与EC有关,Fan等〔6〕发现,miR-145-5p可以通过抑制其靶基因抑制EC的发生和发展。miR-541-5p是新发现的一种肿瘤抑制因子〔7〕,关于其在EC中的作用还未见深入报道。DDX52是一种DEAD/H box RNA解旋酶,以往研究显示,敲低DDX52可显著抑制前列腺癌细胞的生长〔8〕,还未见报道显示DDX52与EC的关系。本研究假设miR-541-5p可能通过调节DDX52在EC的发展中发挥作用,并通过以下研究来验证此假设,以期为EC的治疗提供新参考。

1 材料和方法

1.1组织样本 收集2019年5月至2021年10月哈励逊国际和平医院200例EC组织及邻近非肿瘤食管(Normal)组织。所有患者签署书面知情同意书。术前无患者接受放疗或化疗。本研究得到了哈励逊国际和平医院伦理委员会的批准,且符合世界医学会《赫尔辛基宣言》。

1.2细胞与主要试剂 人食管上皮细胞HET-1A(BNCC337688)与EC细胞系EC9706(BNCC339892)、TE-9(BNCC351845)、ECA-109(BNCC337687)和KYSE180(BNCC351871)获自北京Bena Culture Collection;Trizol总RNA抽提试剂(R0016)、BeyoECL Moon(P0018FS)、增强型CCK-8试剂盒(C0041)获自上海Beyotime;PrimeScript RT reagent试剂盒(RR037A)获自日本TaKaRa;miScript SYBR Green聚合酶链反应(PCR)试剂盒(DXT-218073)获自美国Qiagen;miR-541-5p模拟物(miR-541-5p)及其阴性对照(miR-con)、miR-541-5p抑制物(miR-541-5p inh)及其阴性对照(miR-con inh)和过表达DDX-52(OE-DDX52)及其阴性对照(OE-con)均获自广州RIBIO;RIPA lysis buffer(20-188)获自美国Sigma-aldrich;二喹啉甲酸(BCA)蛋白质测定试剂盒(23229)获自美国Thermo Fisher Scientific;一抗:DDX52(FNab02315)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,FNab03342)、Ki67(FNab09788)、基质金属蛋白酶(MMP)-9(FNab05247)均获自武汉FineTest;DualucifTMFirefly &Renilla测定试剂盒(F6075S)获自上海US EVERBRIGHT INC;BALB/c裸鼠获自中国医学科学院医学实验动物研究所,许可证号:SCXK(京)2021-0004;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(AG1120)获自上海Acmec。

1.3细胞培养 HET-1A、ECA-109和EC9706细胞系维系在DEME培养基中,KYSE180和TE-9细胞系维系在RPMI1640培养基中,所有细胞置于37 ℃,均添加10%胎牛血清和1%青-链霉素。

1.4qRT-PCR分析 通过Trizol试剂从收集的EC组织、Normal组织和不同细胞系中提取总RNA。然后,将RNA合成cDNA,并按照miScript SYBR Green PCR试剂盒说明书进行qRT-PCR测定,评估数据使用2-ΔΔCt法,U6用作内部对照。基因引物:miR-541-5p(正义:5′-CGAAAGGATTCTGCTGTCGGT-3′和反义:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′)和U6(正义:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′和反义:5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′)。

1.5细胞转染与分组 取对数生长期的EC9706细胞或ECA-109细胞,依次分为miR-541-5p组,miR-con组,miR-541-5p inh 组,miR-con inh组,miR-541-5p+OE-DDX52组和miR-541-5p+OE-con组。使用Lipofectamine2000试剂分别转染miR-541-5p(EC9706细胞)、miR-541-5p inh(ECA-109细胞)和miR-541-5p+OE-DDX52(EC9706细胞)及其相应的阴性对照。转染浓度为50 nmol/L,将细胞在新鲜培养基中连续培养48 h以用于后续实验。通过qRT-PCR或Western印迹法分析转染效率。

1.6Western印迹分析 用RIPA裂解液获取转染后的EC9706细胞或ECA-109细胞的蛋白质,并用BCA法进行蛋白浓度鉴定。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离来自每个样品的35 μg总蛋白,转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并在5%脱脂牛奶中封闭1 h。将膜与一抗孵育,包括DDX52和GAPDH。4 ℃过夜。然后使用二抗在室温下覆盖膜45 min。最后,通过电化学发光(ECL)试剂检测条带。通过Image Lab软件分析灰度值。

1.7CCK-8测定 转染后的EC9706细胞或ECA-109细胞以(2×104个/孔)铺板到96孔板中,48 h后向每孔中加入10 μl CCK-8溶液。将细胞与CCK-8溶液一起孵育4 h,然后在450 nm处检测吸光度(OD)值(表示细胞活力)。

1.8集落形成实验 转染后的EC9706细胞或ECA-109细胞以(6×102个/孔)铺板到6孔板中。培养14 d后,细胞用甲醇固定,然后用结晶紫染色。最后使用倒置显微镜对细胞集落进行拍照。使用ImageJ计算>50个细胞的集落。

1.9伤口愈合实验 转染后的EC9706细胞或ECA-109细胞以(5×105个/孔)铺板到6孔板中,当所有孔都充满细胞时,用200 μl无菌移液器吸头刮擦线性伤口。使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤板数次以去除悬浮细胞。并将细胞在无血清的培养基中培养。0、24 h用光学显微镜对同一部位的创面进行成像,计算创面愈合面积〔(总面积-创面面积)/总面积〕。

1.10双荧光素酶报告基因检测 TragetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)被用来预测miR-541-5p的目标基因。将DDX52的野生型(WT)或突变型(MUT)miR-541-5p结合序列插入pmirGLO质粒中,建立重组荧光素酶报告质粒(DDX52-WT和DDX52-MUT)。EC9706细胞用重组荧光素酶报告质粒和miR-541-5p或miR-con共转染。48 h后通过双荧光素酶测定系统检查相对荧光素酶活性。

1.11异种移植实验 共10只雄性无胸腺BALB/c裸鼠(4～6 w,20～25 g)饲养在哈励逊国际和平医院实验动物中心(湿度:50%;温度:25 ℃;光照循环:12 h光照/12 h黑暗;随意进食和饮水)。将裸鼠随机分为2组:miR-con组、miR-541-5p组,每组5只。将miR-541-5p或miR-con转染的EC9706细胞悬浮在PBS中(5×105个/200 μl)并皮下注射到裸鼠的右后腿中。每5 d用卡尺检测肿瘤体积,在第32天通过脊柱脱位处死裸鼠,最后将肿瘤组织标本在4%甲醛溶液中固定或储存在液氮中,qRT-PCR检测miR-541-5p表达。所有程序经哈励逊国际和平医院伦理委员会批准。

1.12HE染色和免疫组化 将固定后的肿瘤组织采用石蜡包埋,并切成5 μm的切片。将切片脱蜡和水化,部分切片用于HE染色。其他切片使用3%过氧化氢(H2O2)孵育30 min,然后用山羊血清在37 ℃下封闭40 min,与一抗(包括DDX52、Ki67和MMP-9)在室温下孵育1 h,然后与二抗孵育45 min。最后使用二氨基联苯胺(DAB)观察染色信号,通过苏木素对细胞核进行复染。在光学显微镜下拍摄图片。

1.13统计学分析 采用GraphPad Prism5.0和SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析和Dunnett-t检验。

2 结 果

2.1miR-541-5p在EC组织和细胞中表达降低 qRT-PCR结果显示,EC组织中miR-541-5p水平较Normal组织显著降低(0.34±0.05 vs 1.04±0.20,P<0.05);在EC细胞系中,与HET-1A细胞(1.02±0.03)比较,ECA-109、EC9706、KYSE180、TE-9细胞miR-541-5p表达(0.46±0.05、0.21±0.02、0.35±0.04、0.40±0.03)显著降低(均P<0.05)。其中,miR-541-5p水平在EC9706细胞中最低,在ECA-109细胞中最高。

2.2miR-541-5p抑制EC细胞增殖和迁移 如表1、图1所示,在miR-541-5p过表达的EC9706细胞中miR-541-5p水平显著升高,而在miR-541-5p敲低的ECA-109细胞中miR-541-5p水平显著降低(P<0.05)。miR-541-5p过表达显著降低了EC9706细胞活力、集落形成数量和创面愈合面积,而敲低miR-541-5p显著增加了ECA-109细胞活力、集落形成数量和创面愈合面积(均P<0.05)。

表1 miR-541-5p对EC细胞增殖和迁移的影响

2.3miR-541-5p靶向DDX52 TargetScan分析预测发现,miR-541-5p可能靶向DDX52,见图2。miR-541-5p模拟物显著降低了DDX52-WT转染的EC9706细胞中荧光素酶活性(P<0.05),而miR-541-5p模拟物对DDX52-MUT转染的EC9706细胞中荧光素酶活性无显著影响(P>0.05)。见表2。

表2 双荧光素酶报告基因证实miR-541-5p与DDX52之间的关系

2.4miR-541-5p通过下调DDX52抑制EC细胞增殖、迁移 miR-541-5p过表达显著抑制了DDX52蛋白水平,而OE-DDX52显著逆转了miR-541-5p模拟物对DDX52蛋白的抑制作用(P<0.05)。与miR-541-5p+OE-con组相比,miR-541-5p+OE-DDX52组EC9706细胞活力、集落形成数量和创面愈合面积均显著增高(P<0.05)。见图3、表3、图4。

2.5miR-541-5p抑制裸鼠肿瘤生长和转移 miR-541-5p过表达后肿瘤组织中miR-541-5p水平显著增加,肿瘤体积、重量显著减小(P<0.05)。HE结果显示,miR-541-5p过表达后肿瘤组织继续生长过程中存在细胞分层紊乱及坏死情况;免疫组化结果显示,miR-541-5p过表达抑制肿瘤组织中DDX52、Ki67和MMP-9表达(P<0.05)。见图5、表4、图6。

1～4:miR-con组、miR-541-5p组、miR-541-5p+OE-con组、miR-541-5p+OE-DDX52组图3 Western检测各组DDX52蛋白表达

表3 miR-541-5p通过下调DDX52对EC细胞增殖、迁移的影响

图4 miR-541-5p通过下调DDX52对EC细胞增殖和迁移的影响(×40)

图5 miR-541-5p过表达对异种移植裸鼠模型中肿瘤组织生长和转移的影响(×200)

表4 miR-541-5p过表达对异种移植裸鼠模型中肿瘤组织生长和转移的影响

图6 裸鼠异种移植瘤图像

3 讨 论

第一个miRNA是1993年发现的,来自秀丽隐杆线虫中的lin-4,被鉴定为一种小的非编码RNA〔9〕。在过去的几十年中,随着越来越多的miRNA被鉴定出来,研究人员逐渐意识到miRNA是一簇短的非编码RNA,可以抑制mRNA结构的稳定性、降低蛋白质的翻译率、破坏蛋白质的调控,参与包括细胞增殖、迁移在内的多个生物过程,并在癌症的发展中发挥作用〔10,11〕。

miRNA组成了一个广泛存在于真核细胞中的大家族,其中一些与mRNA存在靶向关系。基因组分析表明,miRNA靶向的人类基因有5 300多个,占人类基因总数的30%,其表达与癌症密切相关〔12,13〕。研究表明,EC患者和健康人之间存在许多miRNA改变。据报道,miRNA的异常表达与EC的发生发展有关〔4〕,如miR-1304在EC患者组织和血清中的表达增加,可作为EC诊断和复发及该病患者生存率的潜在指标〔14〕。Maghsudlu等〔15〕研究显示,miR-27a和miR-24-2在食管鳞状细胞癌中显著上调,且具有协同作用。此外,研究表明,miR-27b-3p可通过靶向核因子红细胞2相关因子2在食管鳞状细胞癌中发挥抑癌作用〔16〕。本研究结果表明,miR-541-5p在EC进展中起抑制作用。以往研究显示,miR-541-5p可通过靶向环核苷酸磷酸二酯酶1A调节肺纤维化,上调其表达对博来霉素诱导的肺部纤维化具有保护作用〔17〕。另外,一篇报道显示,miR-541-5p在肝细胞癌中上调,可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞凋亡〔18〕。结合以上研究说明,miR-541-5p在不同的癌症中可能发挥不同的作用,因此有必要对其在EC中的作用机制进行探究。

DDX52也称为ROK1,是DEAD-box RNA解旋酶家族的成员,该家族的成员参与各种基于RNA的过程和三磷酸腺苷(ATP)结合,并与多种人类疾病有关,包括精子发生紊乱、病毒感染和癌症〔19〕。先前的研究表明,RNA解旋酶可以作为癌基因并在癌症进展过程中表达上调,例如:DDX10可通过U3小核仁核糖核蛋白4促进肺癌细胞增殖〔20〕。本研究结果表明,miR-541-5p通过负靶向DDX52在EC中发挥抑癌作用。另外,根据现有研究报告显示,敲低DDX52可通过调节抗鼠源原癌基因(c-Myc)信号传导抑制前列腺癌〔8〕、黑色素瘤〔21〕的发展。于是,笔者推测miR-541-5p可能通过调控DDX52调节c-Myc信号抑制EC细胞增殖和迁移,但其具体机制还需更深入探讨。然而,miR-541-5p亦可能与其他基因结合,通过其他信号通路参与EC进展。因此,接下来将探讨miR-541-5p在EC细胞增殖和迁移中的作用机制。此外,许多miRNA可能参与EC治疗,随后将在进一步的研究中探索一组miRNA在EC治疗中的作用。总之,本研究首次证明了miR-541-5p可能通过抑制DDX52来抑制EC细胞的增殖和迁移,为EC患者提供了一个新的治疗靶点。