SGLT-2抑制剂通过Nrf2/HO-1信号通路对2型糖尿病合并高血压大鼠动脉重构的干预作用

庞雅平 韩梅 董帅 姜兰叶

(河北北方学院附属第二医院 1内分泌科,河北 张家口 075100;2手术室;3急诊科)

2型糖尿病合并高血压对心脑血管的危害有协同效应,其中高血压极有可能诱发糖尿病心脑血管和微血管并发症〔1,2〕。临床上2型糖尿病合并高血压患者多伴随发生心脑血管疾病,并伴有视网膜病变、肾脏病变的发生与发展,患者大脑和中枢神经系统功能也会发生异常,脑卒中的风险也显著增加〔3,4〕。钠-葡萄糖协同转运蛋白(SGLT)-2抑制剂阻滞肾脏重吸收葡萄糖进程,使尿液中含过量的葡萄糖,从而降低其在血液中的浓度,是一类新型抗糖尿病药物〔5,6〕。研究表明,SGLT-2抑制剂能有效控制糖尿病患者的血糖水平,对其肾脏和心血管系统具有显著的保护作用,并降低肾损伤和不良事件的发生率〔7,8〕,但其是否能对2型糖尿病合并高血压患者发挥干预作用尚不清晰。核因子-E2相关因子(Nrf)2/血红素氧合酶(HO)-1信号通路在糖尿病并发症中具有多重作用,可以通过核因子(NF)-κB介导的睾丸凋亡和炎症对糖尿病诱导的大鼠生殖损伤的保护作用〔9〕,其表观遗传修饰对糖尿病心血管并发症具有调控作用〔10〕,但Nrf2/HO-1信号通路在2型糖尿病合并高血压中的作用尚不清晰。本研究拟通过建立2型糖尿病合并高血压大鼠模型,探讨SGLT-2抑制剂通过Nrf2/HO-1信号通路对基底动脉重构发挥的干预作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择北京科兴中维生物技术有限公司提供的SPF级雄性自发性高血压大鼠(SHR)40 只和SHR遗传背景相同的 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只,均为7～8周龄,平均体质量(220±20)g,使用许可〔SYXK(京)2020-0054〕,饲养大鼠的温湿度分别为(25±2)℃和(50±5)%,光照间隔12 h。待大鼠适应环境1 w后,进行试验。

1.2主要试剂和仪器 链脲佐菌素(STZ)、苏木素和伊红购于美国Sigma公司;包埋剂(OCT)购于北京普利莱基因技术有限公司;组织蛋白裂解液、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺试剂盒均购于江苏碧云天有限公司;戊巴比妥钠(99%,规格100 g)购于天津化学试剂研究所有限公司;血糖仪购于美国Jhonson医疗器械有限公司;实验动物手术器械购于玉研仪器公司;SYD-K2080切片机购于沈阳誉德电子仪有限公司;H07000FA型透射电子显微镜购于日本日立公司;Western印迹电泳仪购于美国Bio-Rad公司。

1.3大鼠模型建立 SHR高糖高脂饮食联合STZ建立2型糖尿病合并高血压大鼠模型,SHR高糖髙脂饲料喂养2 w,禁食12 h,腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg,1 w后,空腹12 h,使用血糖仪大鼠尾血的血糖水平,造模成功标准为血糖≥16.7 mmol/L。造模成功后随机选取30只大鼠分为模型组和试验组各15只,另取与SHR遗传背景相同的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只为对照组,试验组1 mg/(kg·d)达格列净灌胃,模型组和对照组给予等量生理盐水灌胃,8 w后进行检测。

1.4大鼠基底动脉分离 腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉大鼠,取仰卧位,打开腹腔后,经左心室插管主动脉,剪开右心房,快速灌注含肝素(100 U/kg)生理盐水5 min。然后灌注4 ℃ 4%多聚甲醛/PB溶液(Na2HPO4·12H2O 100 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 100 mmol/L,pH7.4)15 min,开颅取脑,将基底动脉血管暴露出来。先用4%多聚甲醛固定血管,然后用石蜡包埋起来,再用竹签轻轻磨掉剩余部分的内皮,样品置于-80 ℃冰箱中,待后面检测。

1.5苏木素-伊红(HE)染色检测基底动脉病理变化 石蜡切片机将石蜡包埋组织切成4 μm厚度片状,60 ℃烘箱5 min;二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ依次脱蜡20 min和10 min,1/2二甲苯+1/2无水乙醇-100%-95%-85%-70%-50%乙醇各1 min,自来水冲洗15 s;苏木素染色5 min,自来水冲洗1 min,切片变蓝;1%盐酸乙醇分化10 s,自来水冲洗1 min;1%稀氨水返蓝10 s,自来水洗1 min;伊红染色1 min,自来水洗30 s;再依次使用不同浓度的乙醇脱水1 min,95%乙醇漂色1 min,无水乙醇脱水5 min,最终依次放在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各3 min,在显微镜下观察中性树胶封片。

1.6免疫荧光检测核增殖指数(Ki67)表达水平 用冰冻切片机将大鼠的包埋组织切成6 μm厚度切片,使用60 ℃高温去除OCT,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,5 min/次;经0.1%TritonX-100透膜5 min,用PBS洗3次,5 min/次;经5%牛血清白蛋白(BSA)封闭切片0.5 h后,甩干,4 ℃下,在切片中加入一抗anti-Ki67(1 μg/ml,ab15580,Abcam,英国),肌动蛋白α抗体(1 μg/ml,ab7817,Abcam,英国)过夜反应,然后用PBS洗3次,5 min/次;室温下在切片上滴加二抗,避光孵育1 h然后用PBS洗3次,5 min/次,应用激光共聚焦显微镜观察拍照。

1.7透射电镜观察大鼠基底动脉超微结构 各组大鼠开颅取脑后取出含脑基底动脉血管在内的3 mm厚的脑组织,在4 ℃条件下,电镜固定液中固定12 h,用PBS洗3次,5 min/次;4 ℃下,使用锇酸后固定1.5 h,用PBS洗3次,5 min/次;浓度递增的乙醇-无水丙酮脱水10 min;Epon812包埋剂进行包埋,使用超薄切片机切片,厚度为80 μm,并采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,应用H07000FA型透射电子显微镜观察组织的超微结构。

1.8Western印迹检测大鼠Nrf2和HO-1 蛋白表达水平 基底动脉组织置于液氮中研磨至匀浆,提取总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度。加SDS的蛋白上样缓冲液(×5)并煮沸,分装保存于-80 ℃冰箱备。样品放置在不同泳道中,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,浓缩胶电压设置为80 V,分离胶电压设置为120 V,转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,用5%BSA封闭。加入1∶1 000特异性一抗Anti-Nrf2抗体(ab92946,Abcam,英国),1∶10 000 HO-1(ab68477,Abcam,英国),1∶2 000 GAPDH(sc-47724,Santa Cruz,美国),并在4 ℃冰箱中过夜反应。TBST洗膜3次后,加入1∶5 000特异性的羊抗兔二抗,孵育1 h。继续使用TBST洗膜3次,采用电化学发光(ECL)液曝光显影,半定量分析通过Photoshop图像分析软件系统进行。

1.9统计学处理 采用SPSS23.0软件进行Student-t检验,各时间点的比较采用重复测量方差分析。

2 结 果

2.1各组血糖比较 如表1所示,建模成功后给抑制剂前,模型组和试验组空腹血糖差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于对照组(P<0.05);给抑制剂8 w后,试验组空腹血糖显著低于模型组,但仍明显高于对照组(P<0.05)。

2.2各组Ki67表达水平比较 如表1、图1所示,与对照组相比,模型组和试验组Ki67表达显著增加(P<0.05),试验组Ki67表达明显低于模型组(P<0.05)。

图1 各组基底动脉Ki67表达(免疫荧光,×200)

2.3大鼠基底动脉Nrf2和HO-1蛋白表达 如表1、图2所示,与对照组相比,模型组基底动脉Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,试验组Nrf2和HO-1蛋白表达显著上升,但仍明显低于对照组(P<0.05)。

表1 各组血糖、Ki67表达水平及Nrf2、HO-1蛋白表达比较

图2 各组基底动脉Nrf2和HO-1蛋白表达

2.4各组基底动脉病理比较 如图3所示,与对照组相比,模型组基底动脉血管壁厚管腔内径管腔外径和中膜面积均明显增加,试验组基底动脉血管壁厚管腔内径管腔外径和中膜面积相对于模型组有所降低,但仍高于对照组。

图3 各组基底动脉病理(HE染色,×400)

2.5各组基底动脉超微结构比较 如图4所示,对照组细胞排列整齐有序,结构良好且完整,模型组细胞排列紊乱,线粒体出现空泡,部分甚至出现肿胀和嵴断裂,胶原纤维量增加。试验组细胞的超微结构得到改善,细胞排量相对整齐,线粒体空泡化较少,胶原纤维减少。

图4 各组基底动脉超微结构(×200)

3 讨 论

2型糖尿病合并高血压是一种慢性疾病,患者临床特征为高血糖、相对缺乏胰岛素、胰岛素抵抗等,经常合并多种心脑血管、代谢和肾脏病,如高血压、血脂异常和心力衰竭等,长期高血糖带来的并发症包括脑卒中、心脏病等,会产生大血管和微血管并发症,对糖尿病患者的生活质量有较大影响,已经成为一个主要的公共卫生问题〔11,12〕。SGLT-2是一种现代降糖药物,除了糖尿病患者血糖控制和心血管保护方面的积极结果外,还与血压降低和肾功能改善有关,近年来在糖尿病患者中的应用有所增加。越来越多关于新型降糖药的证据证明,SGLT-2与糖尿病相关的非靶向益处,尤其是对心脑血管和肾脏结局的显著改善具有促进作用〔13,14〕。SGLT-2能够持续适度但显著地降低收缩压和舒张压,这是传统降糖药没有针对性和观察到的效果,除了这种降压作用外对其他心脏代谢和肾脏参数也有多方面的有益影响,其临床意义现在已经超出了其降血糖作用,从而提供了一种新的正常策略,用于循证、以患者为中心的糖尿病护理方法〔15,16〕。本研究证实,SGLT-2抑制剂可以降低大鼠血糖水平,这与当前临床队列研究结果相一致;本研究结果提示,对基底动脉异常增殖的抑制作用,可能是心脑血管保护作用机制之一;同时本研究发现,SGLT-2抑制剂降低了细胞损伤,减少了异常线粒体的出现,降低了线粒体嵴断裂,提示其具有更好的细胞代谢功能,由此推测SGLT-2抑制剂对基底动脉的保护作用可能在降低血糖的同时,干预细胞异常增殖,从而维护细胞正常代谢功能。

Nrf2/HO-1途径是防御氧化应激的内在机制,Nrf2作为一种转录因子可诱导大量细胞因子从而发挥重要的调节作用〔17,18〕。研究表明,Nrf2/抗氧化物反应元件(ARE)通路的调控可以改善大鼠糖尿病相关的焦虑和抑郁样行为〔19〕,也有研究证实,Nrf2表达及其下游靶点活化如HO-1、醌氧化还原酶(NQO)-1、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLM)可抑制高糖诱导的Toll样受体(TLR)4/核因子(NF)-κB轴活化,参与糖尿病肾病患者的血清铁蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和高迁移率族蛋白(HMG)B1水平升高,对糖尿病肾病发挥干预作用〔20〕。本研究结果提示,SGLT-2抑制剂对基底动脉重构的保护作用可能是通过Nrf2/HO-1信号通路的抑制实现的。

综上,SGLT-2抑制剂可以对2型糖尿病合并高血压大鼠基底动脉重构发挥干预作用。其机制可能与Nrf2/HO-1信号通路的调控相关。