辣木叶发酵物通过NGF/TrkA通路调控LC3、Beclin-1表达改善血管性痴呆小鼠学习记忆能力和神经功能

孙杨 刘媛媛 隋月林 朱建忠 尹帅 赵灿 陈玲

(1沧州医学高等专科学校解剖教研室,河北 沧州 061001;2河北省沧州中西医结合医院)

血管性痴呆(VD)是脑缺血-再灌注损伤的常见并发症,临床表现为学习记忆功能受损,严重影响患者生活质量,但是目前VD的机制仍不完全明确〔1〕。自噬过程是细胞器或大分子蛋白被溶酶体降解过程,最新研究显示,自噬的升高会影响VD海马神经元功能,而抑制自噬则可促进突触再生〔2〕。自噬过程受到神经生长因子(NGF)/神经营养因子受体A型(TrkA)通路的调控,研究显示,NGF/TrkA通路的升高能够保护前角运动神经元免受2,5-己二酮诱导的自噬损伤〔3〕。辣木叶可作为食物,有研究显示,其具有抗氧化、提高记忆力、促进神经元存活等作用,辣木叶发酵物的营养成分和抗氧化能力均升高〔4〕。

研究显示,辣木叶发酵物能够减轻同型半胱氨酸诱导的阿尔茨海默病动物模型的神经损伤,保护学习、记忆功能〔5〕,然而,其是否对VD具有保护作用尚未见研究。本研究主要分析辣木叶发酵物对VD小鼠学习记忆能力的影响,并分析其对NGF/TrkA通路和海马神经元自噬的影响。

1 材料与方法

1.1实验材料 BALB/c小鼠〔SPF级,雄性,6～8周龄,体质量(20±2)g,河北医科大学实验动物中心,合格证:医动字第04057号〕。莫里斯水迷宫(XR-XM101,上海新软信息技术有限公司,中国)。苏木素-伊红(HE)试剂盒(碧云天公司,中国)。Trizol试剂(Aidlab公司)。RNAspin Mini试剂盒(GE Healthcare,美国)。BestarTM荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒(DBI Bioscience公司,德国)。抗体、一抗和山羊抗免疫球蛋白G(IgG)二抗(1∶1 000稀释,#ab6721,Abcam公司,美国)。聚偏氟乙烯膜(EMD Millipore,美国)。电化学发光(ECL)显色试剂盒(Thermo Fisher公司,美国)。显微镜(Carl Zeiss公司,德国)。

1.2小鼠分组 150只小鼠随机分为对照组、VD组、辣木叶发酵物低、中、高剂量组各30只。根据参考文献〔6〕,通过Himori法构建VD模型:小鼠通过腹腔注射戊巴比妥(1%,20 g/L,2 ml/kg)麻醉,仰卧固定后暴露双侧颈动脉,利用栓线阻断双侧颈总动脉10 min,然后再灌注24 h。通过水迷宫实验检测目标象限停留时间<20 s且穿越平台次数<4次为建模成功。对照组小鼠仅暴露双侧颈动脉。辣木叶发酵物低、中、高剂量组根据参考文献〔7〕制备辣木叶发酵物并灌胃,剂量分别为100、200、400 mg/kg,1次/d,连续28 d。对照组及VD组每日等体积双蒸水灌胃。

1.3水迷宫实验 实验前准备:将水迷宫(1.6 m×1.6 m × 40 cm)放在一个安静、无干扰的房间中,水位〔水温(25±1)℃〕通常设置在迷宫的一半位置。在迷宫的一个入口处放置一个台子,用来让动物跳入水中。训练阶段:在入口处放入动物就喜欢的奖励(小块食物),然后将动物放在迷宫中的一个位置,并让它们寻找出口。当动物到达目标区域时,会发现隐藏的奖励并获得食物奖励。通常需要多次训练,直到动物熟悉迷宫结构并且能够正确地找到出口。记忆测试:在训练完成后,去掉水迷宫中的奖励,让动物再次跳入水中并寻找出口位置。通过观察动物是否能够记得迷宫结构并正确地找到出口位置来测试它们的空间记忆和学习能力。

1.4HE染色 海马组织在10%中性缓冲甲醛溶液中固定24 h,包埋在最佳切割温度溶液中并在矢状面上切片。5 μm厚的切片在递减的乙醇梯度中水合后,切片均脱石蜡并在37 ℃下用苏木素溶液染色5 min。倒置光学显微镜观察。

1.5RT-qPCR 使用Trizol试剂盒提取海马组织的总RNA,并进行逆转录,生成cDNA。SYBR Green试剂用于qPCR扩增,反应条件为:95 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,58 ℃ 20 s,72℃ 2 s,40个循环,最后在72 ℃下延伸4 min。使用2-ΔΔCt方法将微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、Beclin1、NGF和TrkA mRNA相对于GAPDH标准化。

1.6Western印迹 海马组织的裂解液通过100 μl裂解液体+1 μl蛋白酶抑制剂+1 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)获得。离心(12 000 r/min,4 ℃,15 min)后,将上清液收集到另一个1.5 ml的EP管中。将2.5 μl样品加入22.5 μl超纯水中通过二喹啉甲酸(BCA)来测量蛋白质浓度。8%～12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用于分离。分别加入1∶800稀释的LC3、Beclin1、NGF和TrkA一抗(4 ℃,过夜),然后将其与二抗(1∶2 000)在37 ℃下孵育 2 h。采用ECL和IPP6.0进行印迹可视化,相对表达量通过内参GAPDH得到。

1.7统计学处理 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1辣木叶发酵物对VD小鼠学习记忆功能的影响 VD组目标象限停留时间和穿越平台次数显著低于对照组(P<0.05);辣木叶发酵物低剂量组目标象限停留时间和穿越平台次数显著高于VD组(P<0.05);辣木叶发酵物中剂量组目标象限停留时间和穿越平台次数显著高于辣木叶发酵物低剂量组(P<0.05);辣木叶发酵物高剂量组目标象限停留时间和穿越平台次数显著高于辣木叶发酵物中剂量组(P<0.05),且基本恢复至对照组水平。见表1。

表1 各组水迷宫实验比较

2.2辣木叶发酵物对VD小鼠海马组织损伤的影响 在细胞结构上,对照组海马神经元具有清晰的形态,细胞核大小适中且圆形,位于细胞的中央。相比之下,VD组海马神经元呈现核凝聚、空泡化及炎症细胞浸润现象。而接受辣木叶发酵物低剂量处理的组别中,核凝聚和空泡化现象有所缓解,相较VD组表现更加良好。辣木叶发酵物中剂量组的核凝聚、空泡化情况显著减少。辣木叶发酵物高剂量组海马组织神经元基本恢复,仅有少量空泡化。见图1。

图1 辣木叶发酵物对VD小鼠海马组织损伤的影响(HE染色,×400)

2.3辣木叶发酵物对VD小鼠海马神经元自噬水平的影响 VD组LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05)。辣木叶发酵物低剂量组LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表达显著低于VD组(P<0.05);辣木叶发酵物中剂量组LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表达显著低于辣木叶发酵物低剂量组(P<0.05);辣木叶发酵物高剂量组LC3、Beclin1 mRNA及蛋白表达显著低于辣木叶发酵物中剂量组(P<0.05)。见图2、表2。

2.4辣木叶发酵物对VD小鼠海马神经元中NGF/TrkA通路蛋白水平的影响 VD组NGF、TrkA mRNA及蛋白表达显著低于对照组(P<0.05)。辣木叶发酵物低剂量组的NGF、TrkA mRNA及蛋白表达显著高于VD组(P<0.05);辣木叶发酵物中剂量组NGF、TrkA mRNA及蛋白表达显著高于辣木叶发酵物低剂量组(P<0.05);辣木叶发酵物高剂量组NGF、TrkA mRNA及蛋白表达显著高于辣木叶发酵物中剂量组(P<0.05)。见图2、表2。

1～5:对照组、VD组、辣木叶发酵物低剂量组、辣木叶发酵物中剂量组、辣木叶发酵物高剂量组图2 Western印迹检测各组LC3、Beclin1、NGF、TrKA表达蛋白

表2 辣木叶发酵物对VD小鼠海马神经元中LC3、Beclin1、NGF、TrkA mRNA及蛋白表达水平的影响

3 讨 论

VD是由脑血管疾病引起的神经性疾病,是全球第二大最常见的痴呆形式,患者往往表现出高级认知能力的严重损害〔8〕。VD的发病机制涉及胆碱能系统、氧化自由基产生、一氧化氮、兴奋性氨基酸等多方面损伤,且与认知功能相关〔9〕。但是目前尚无治疗VD的特效方法,寻找有效缓解VD患者学习记忆能力损伤的药物具有重大临床意义。

作为一种食物和天然药物,辣木叶具多种生物学活性,包括抗糖尿病、抗感染、抗癌、抗缺血、抗疟原虫等〔10〕。发酵是用于增强豆类、谷物等植物性食品营养品质的生物技术方法之一,发酵食品的营养价值早已得到认可,研究显示,辣木叶发酵物对高胆固醇血症大鼠的缓解作用明显〔11〕。辣木叶具有抗氧化和神经保护作用,如Adebayo等〔12〕研究显示,长期食用辣木叶补充饮食可促进机体抗氧化能力并增强大鼠海马的神经认知及保护神经功能。也有研究显示,辣木叶可保护大脑免受实验性尼古丁诱导的神经行为障碍和小脑变性的影响〔13〕。Jaafaru等〔14〕研究也显示,辣木叶能够减轻过氧化氢诱导的人类神经元损伤和凋亡,并有助于恢复神经元的形态特征,但是关于辣木叶发酵物是否会缓解VD神经损伤仍不清楚。本研究发现,辣木叶发酵物能够有效改善VD小鼠神经功能障碍,并且随着剂量的升高,改善作用更加明显。根据本研究结果和过往文献,说明辣木叶发酵物能够显著改善VD小鼠的学习记忆功能,缓解海马神经元损伤。

自噬会被细胞所处的环境压力诱导,氧化应激不但是VD的重要诱因,也是诱导自噬重要因素,细胞为维持细胞存活,会将细胞器、蛋白运送至溶酶体降解为小分子物质并被重新利用,而过度的自噬不但会影响细胞的正常功能,还会引起神经元凋亡〔15,16〕。研究显示,VD中LC3、Beclin1等自噬蛋白升高,海马神经元的正常功能受到抑制〔17〕。神经元的自噬水平和功能受到NGF/TrkA通路的调控,研究显示,NGF/TrkA通路会调控神经细胞中的自噬通量促进髓鞘碎片清除并加速神经再生〔18〕。本研究结果显示,辣木叶发酵物能够有效促进NGF/TrkA通路并抑制自噬,并且随着剂量的升高,促进作用更加明显。研究显示,辣木叶的结肠代谢物可通过细胞凋亡和自噬调控结肠癌细胞的存活〔19〕。根据本研究结果和文献报道,提示辣木叶发酵物可能通过促进NGF/TrkA通路来抑制海马神经元中的自噬水平,从而促进神经元的功能,进而保护VD小鼠的学习记忆功能。

综上,辣木叶发酵物能够保护VD小鼠学习记忆功能,促进海马神经元中NGF/TrkA通路并抑制自噬。然而,本研究结果虽然初步得到辣木叶发酵物保护VD小鼠神经功能的机制可能与NGF/TrkA通路和自噬有关,仍需体内或体外实验进行验证;此外,辣木叶发酵物缓解VD的作用和安全性仍需要临床研究证实。