百香果果皮总黄酮对D-半乳糖所致衰老小鼠海马的影响

黄彦峰 张丽凤 黄永毅 庞文杰

(右江民族医学院,广西 百色 53000)

随着全球人口老龄化进程的加剧,人们对抗衰老功能食品的需求越来越大,抗衰老已成为研究领域关注的热点。百香果又称西番莲、巴西果、鸡蛋果,是西番莲科(Passiflor aceae)植物果实,有“果汁之王”的美誉,是一种典型的药食同源的高品质水果,具有很高的药用价值和食用价值〔1〕。国内外对百香果化学成分研究较多,对其的果实、果汁、果皮、种籽都有研究,它们含有的化学成分主要为酚类、黄酮苷类、生物碱等,具有多种药理活性〔2～4〕,但目前百香果果皮总黄酮对D-半乳糖所致衰老小鼠海马的影响研究少有报道。Simirgiotis 等〔5〕研究发现百香果果皮中黄酮类化合物的含量是果肉(汁)的1.81 倍,丰富的生物活性成分使其具有抗炎、抗氧化、抗皮肤衰老、降血压等作用〔6〕。黄酮类化合物可作为信号分子、衰老基因及信号通路延缓衰老。课题组前期研究发现,百香果果汁有较好的延缓衰老的作用。本文采用D-半乳糖建立衰老模型小鼠,探讨百香果果皮总黄酮对衰老小鼠海马的影响。为百香果的药用开发及寻找延缓脑衰老的方法提实验依据。

1 材料与方法

1.1主要药物及试剂 兔抗鼠B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗体、兔抗鼠Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体均购于Bioss公司(货号Bs0127r,Bs0032r),兔抗鼠半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 多克隆抗体(购于Affinity公司,货号AF7022);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰胆碱(ACh)、单胺类神经递质催化酶(MAO)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所(货号分别为A001-3,A003-1,A105-1-1,A034-1-1);维生素C(国药准字H4103317,遂成药业股份有限公司);D-半乳糖(solarbio公司,货号301L052);百香果(广西百色市售)。

1.2主要仪器与设备成像系统(日本OLYMPUS),图像分析软件(美国Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus),光学显微镜(日本OLYMPUS),PAT-8M 小鼠避暗实验系统(成都泰盟软件有限公司),酶标仪(Tristar LB 941 德国),离心机(北京离心机厂)。

1.3百香果果皮总黄酮的提取〔7〕称取百香果果皮粉末200 g→加70%乙醇3 000 ml→超声波提取(提取时间2 h,提取温度60 ℃,超声功率为100 W)→ 减压抽滤→旋转蒸发浓缩至200 ml即得母液(1 g/ml)。置于4 ℃冰箱保存,用时稀释成相应浓度。本实验以芦丁为对照品,采用回归方程计算百香果果皮总黄酮含量为2.938 mg/g。

1.4实验动物分组及给药 SPF级小鼠60只,雌雄各半,体质量24～28 g,由右江民族医学院动物实验中心提供,合格证号:SCXK(湘)2019-0014。将小鼠随机分为6组:空白组,模型组、阳性组(100 mg/kg维生素C)、百香果果皮总黄酮高(1.00 g/kg)、中(0.50 g/kg)、低(0.25 g/kg)组。空白组小鼠每日腹腔注射生理盐水,其余小鼠每日腹腔注射D-半乳糖(500 mg/kg),腹腔注射的同时,空白组和模型组每日灌胃同体积蒸馏水,其余各组均灌胃同体积相应剂量的药液,小鼠均按0.1 ml/10 g的剂量给药,每日1次,连续42 d。

1.5学习和记忆能力测试 避暗实验分为训练和正式两个阶段,给药第40天进行训练测试,训练时将小鼠头背着洞口放入明室适应3 min,暗室的避暗仪底部通36 V,50 Hz交流电,小鼠进入暗室就会受电击,正确的反应是逃往明室,此过程为训练测试,以此反映的学习能力。24、48 h 后(给药的第41、42天)分别对小鼠进行测试,记录5 min内小鼠进入暗室的次数(即为错误次数),第1次进入暗室的时间(即避暗潜伏期),以此反映小鼠的记忆能力。

1.6生化指标检测 避暗实验结束后颈椎脱臼处死小鼠,剖腹取小鼠全脑组织加入9 倍体积的冰冻生理盐水,制备10%的组织匀浆液,离心取上清液,用酶标仪按照试剂说明书测定其吸光度,计算小鼠脑组织中SOD、MDA、ACH、MAO含量。

1.7观察脑组织海马区的病理形态学变化 取出脑组织在冰盒上剥离海马组织,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察病理组织学改变。

1.8检测海马组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达 取1.7中蜡块切片后放入柠檬酸修复液高压修复,清洗,加一抗工作液4 ℃过夜,第2天磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加二抗工作液,37 ℃孵育30 min,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染、分化、反蓝。在显微镜下观察,依据阳性免疫反应判断阳性细胞表达,应用计算机图像处理系统及分析软件进行图像分析。依据阳性免疫反应的图像选取阳性表达区域,以人机交互方式测定阳性免疫染色强度及面积,结果以平均光密度值表示。

1.9统计学方法 采用SPSS26.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1避暗实验测定百香果果皮总黄酮对衰老小鼠学习和记忆能力的影响 由表1可知,与空白组比较,模型组避暗潜伏期显著缩短(P<0.01),错误次数明显增加(P<0.05);与模型组比较,阳性组及百香果果皮总黄酮高、中、低组避暗潜伏期明显延长(P<0.01),错误次数明显减少(P<0.05)。表明在避暗实验中,百香果果皮总黄酮能改善衰老小鼠的学习和记忆能力。

表1 避暗实验测定百香果果皮总黄酮对衰老小鼠学习和记忆能力的影响

2.2百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织SOD、MDA、MAO、ACH含量的影响 由表2可知,与空白组比较,模型组脑组织的SOD、ACH含量显著下降(P<0.01),MDA、MAO含量显著上升(P<0.01);与模型组比较,阳性组及百香果果皮总黄酮高、中、低组脑组织的SOD、ACH活力明显上升(P<0.05,P<0.01),MDA、MAO含量显著下降(P<0.01)。说明百香果果皮总黄酮可能是通过提高小鼠脑组织的SOD、ACH活力,降低MDA、MAO含量而发挥抗衰老作用。

2.3百香果果皮总黄酮对衰老小鼠海马组织Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响 由表2、图1～3可知,与空白组比较,模型组海马区Bax、Caspase-3 阳性细胞表达明显增加(P<0.05),Bcl-2阳性细胞表达明显下降(P<0.05);与模型组比较,除百香果果皮总黄酮低组Caspase-3差异无统计学意义外,阳性组及百香果果皮总黄酮高、中、低组海马组织上述指标差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。表明百香果果皮总黄酮能减少海马区细胞死亡的数量,改善衰老小鼠学习记忆能力,可能与上调Bcl-2 阳性细胞表达、下调Bax、Caspase-3 阳性细胞表达有关。

表2 百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织SOD、MDA、MAO、ACH含量及组织Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响

图1 百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马区Bax的表达(HE染色,×400)

2.4百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马区病理形态学的影响 由图4可知,空白组海马区神经元细胞整体形态结构正常,CA1区锥体细胞排列整齐,染色均匀,无明显凋亡及坏死,无空泡样变性,无炎细胞浸润。模型组海马区神经元细胞损伤较严重,CA1区细胞排列紊乱,染色不均匀,出现明显空泡状结构,大量神经元固缩,凋亡;出现少量炎细胞浸润。与模型组比较,阳性组、百香果果皮总黄酮高、中、低组小鼠海马区神经元细胞损伤较轻,CA1区细胞排列略显紊乱,有少量空泡状结构,少量神经元固缩,凋亡;整体损伤较模型组减轻,无明显炎细胞浸润。神经元细胞结构有改善,表明百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马CA1 区细胞具有保护作用。

图2 百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马区Caspase-3的表达(HE染色,×400)

图3 百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马区Bcl-2的表达(HE染色,×400)

图4 百香果果皮总黄酮对衰老小鼠脑组织海马区病理形态学的影响(HE,染色×400)

3 讨 论

衰老是机体各组织、器官功能随年龄增加而发生的退行性变化,生理功能逐渐衰退,机体抵御外界伤害和恢复体内平衡的能力都下降。目前,衰老的确切机制还不明确,存在多种学说,自由基学说是被科学家认可的衰老学说之一。自由基学说认为机体内的抗氧化防御与自身产生的自由基在正常生理条件下维持相对平衡,而机体衰老过程会产生超出机体抗氧化能力大量自由基,使体内自由基的产生和机体的抗氧化防御之间产生不平衡,这被称为氧化应激,可导致细胞受损甚至死亡,同时氧化应激还会随着衰老而加重〔8～10〕。SOD 是机体内重要的抗氧化酶,能够清除机体内多余自由基〔11〕。MDA 是体内不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物,常作为评价细胞和器官衰老的重要指标〔12〕。大脑组织需氧量大,抗氧化能力弱且对氧化应激损伤较敏感,会随着机体衰老程度对氧化应激损伤敏感性增强〔13〕,本实验结果提示百香果果皮总黄酮能有效提高衰老小鼠体内抗氧化酶含量,减弱因自由基增多而发生氧化应激,延缓机体衰老进程。

衰老常伴学习和记忆能力的下降,学习是神经系统接受外界环境改变而获得新行为、经验的过程,记忆是学习后经验的识记、保持和再现,因此学习和记忆是有联系的神经过程,有赖于全脑功能的整合〔14〕。ACH是胆碱能系统重要的神经递质,随年龄的增长其含量会下降,大脑组织中ACH 含量高可增强学习与记忆能力〔15〕。MAO广泛存在于肝、肾、脑等组织中,体内含量升高可提升体内H2O2浓度,对大脑海马神经元造成损伤,导致大脑的学习、记忆和认知功能有不同程度的减退〔16〕。目前建立记忆损伤模型方法较多,但避暗实验是最常用的动物学习记忆实验方法。本实验提示百香果果皮总黄酮能提高衰老小鼠学习记忆能力,干预衰老进程。学习记忆以神经元为物质基础,海马的结构及功能跟学习记忆能力密切相关,海马神经元衰老或丢失严重影响学习与记忆能力。细胞凋亡在脑的发育过程起重要的作用。诱导细胞凋亡的细胞因子很多,其中抗凋亡基因(如Bcl-2)和促凋亡基因(如Bax)是这个家族中的重要成员。Bax表达过量,形成同源二聚体Bax/Bax,可促进细胞凋亡;Bcl-2表达过量,形成异源二聚体Bcl-2/Bax,可促进细胞周期和细胞增殖,从而抑制细胞凋亡〔17〕。Caspase-3 是 Caspase下游关键的凋亡执行蛋白酶,在细胞凋亡过程中起重要作用〔18〕。本文结果提示百香果果皮总黄酮能通过促进细胞周期和细胞增殖,抑制细胞凋亡,能拮抗D-gal 所致衰老小鼠海马损伤,从而延缓海马衰老。

综上所述,百香果果皮总黄酮能改善衰老小鼠的学习记忆能力,能减轻衰老小鼠的氧化应激反应,能改善海马组织CA1 区神经元细胞结构、抑制海马神经细胞凋亡,推测其机制可能与抑制氧化应激及上调Bcl-2 、下调Bax及Caspase-3 表达有关。具体的抗衰老作用机制,还需要进一步研究。