柴胡皂苷A调控PI3K/Akt通路对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响

林玉玲 李玉杰 李增一 刘琳 籍胤玺

(南阳市中心医院,河南 南阳 473000)

糖尿病主要是由长期高血糖、高血脂及胰岛素抵抗、胰岛β细胞受损引起的,其中2型糖尿病(T2DM)的发病率最高〔1,2〕。T2DM的主要病理特征为慢性高血糖及胰岛素抵抗〔3〕,基于T2DM发病率的逐年上升及并发症较为严重,公认的降糖类药物盐酸二甲双胍具有刺激脾胃的副作用〔4〕,因此寻找新的高效安全的替代药物成为临床上治疗糖尿病的关键。中草药成为目前的研究热点,其中柴胡皂苷A是中药柴胡的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗菌、抗病毒及保肝护肾的作用〔5〕。肝脏在全身代谢中发挥重要作用,T2DM发生过程中,肝脏胰岛素抵抗导致机体糖脂代谢紊乱〔6〕。胰岛素抵抗与胰岛素信号通路密切相关,其中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路是胰岛素信号通路的一个环节〔7〕。研究表明〔8〕,胰岛素受体激活其下游的PI3K与胰岛素受体底物结合,诱导Akt磷酸化,发挥调节糖代谢的作用。本研究探究柴胡皂苷A对T2DM小鼠胰岛素抵抗的作用及相关通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性BALB/c小鼠60只,4～6周龄,体质量18～20 g,由河南省实验动物中心提供,许可证号为SCXK(豫)2017-0001。实验动物饲养于温度22～25 ℃,湿度45%～50%的环境中,给予充足的食物、水,昼夜交替12 h。

1.2实验药物与试剂 柴胡皂苷A(H811102,深圳海思安生物技术有限公司);盐酸二甲双胍(C14202003084,中美上海施贵宝制药有限公司);链脲佐菌素(STZ,sl8566,北京康纳瑞生物科技有限公司);胰岛素(91077C,美国SIGMA公司);小鼠空腹胰岛素(FINS)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(FT-P9S2076X,上海梵态生物科技有限公司);三酰甘油(TG,SH-1259)、总胆固醇(TC,SH-1256)、游离脂肪酸(FFA,SKT-1594)检测试剂盒(北京凯诗源生物科技有限公司);苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(G1120)、放射免疫沉淀测定(RIPA)高效蛋白裂解液(R0010)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒(PC0020)、电化学发光(ECL)试剂盒(SW2010,北京索莱宝生物技术有限公司);PI3K(4292S)、Akt(9272S)、p-Akt(9271S)一抗、羊抗兔IgG二抗(7074S)购自美国CST公司。

1.3实验仪器 PI-400无创血糖仪(广州菲康生物技术有限公司);OLYMPUS IX53显微镜(日本OLYMPUS公司);JY04S-3C凝胶成像分析系统(北京君意东方电泳设备有限公司)。

1.4模型建立与分组给药 小鼠适应性饲养1 w后随机分为对照组、模型组、阳性对照组、柴胡皂苷A低、中、高剂量组各10只。对照组饲喂普通饲料,其余5组饲喂高脂饲料,连续饲喂4 w,自由饮水。第5周开始,除对照组外,其余5组给予腹腔注射STZ,连续注射3 d,诱导T2DM模型,以空腹血糖(FBG)>11.1 mmol/L为建模成功〔9〕。建模成功后给药,参照文献〔10〕进行等效剂量换算,阳性对照组给予盐酸二甲双胍溶液250 mg/kg〔11〕灌胃;柴胡皂苷A低、中、高剂量组分别给予5、10、20 mg/kg〔12〕柴胡皂苷A溶液灌胃;对照组与模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续给药4 w。

1.5胰岛素耐量实验 给药15 d后禁食12 h,其间不禁水,腹腔注射胰岛素溶液2 U/kg,分别在0、30、60和120 min时取尾静脉血,测定血糖值(Glu),并计算血糖-时间曲线下面积(AUC)。AUC=0.5×(Glu0 min+Glu30 min)/2+0.5×(Glu30 min+Glu60 min)/2+1×(Glu60 min+Glu120 min)/2。

1.6小鼠血清FBG、FINS的测定及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)的计算 给药结束后禁食12 h,麻醉小鼠,眼球取血,离心分离血清,采用血糖仪检测各组小鼠FBG,ELISA检测FINS含量,计算HOMA-IR。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.7小鼠肝组织病理学变化的观察 处死小鼠,取出肝脏,清洗擦干,经4%多聚甲醛固定后进行梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片,进行HE染色,显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.8小鼠肝组织中TG、TC及FFA的检测 肝组织与生理盐水按照1∶9的比例制备匀浆,离心后取上清,按照试剂盒说明书进行操作,检测肝组织中TC、TG、FFA含量。

1.9小鼠肝组织中PI3K/Akt通路相关蛋白表达的检测 处死小鼠,分离肝组织,加入RIPA高效蛋白裂解液,离心后取上清,采用BCA法检测总蛋白浓度。取30 μg蛋白上样,进行电泳、转膜,5%脱脂牛奶封闭,加入稀释好的PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗,4 ℃孵育,加入稀释好的二抗,室温孵育,TBST洗膜,采用ECL法显色,以β-actin为内参,运用凝胶成像分析系统分析灰度值,计算目的蛋白相对表达量。

1.10统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1柴胡皂苷A对T2DM小鼠糖代谢功能的影响 与对照组比较,模型组AUC明显升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组与柴胡皂苷A各剂量组AUC均显著降低(P<0.05),且柴胡皂苷A各剂量组间具有剂量效应(P<0.05);与阳性对照组比较,柴胡皂苷A低、中剂量组AUC显著升高(P<0.05),柴胡皂苷A高剂量组具有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2柴胡皂苷A对T2DM小鼠胰岛素抵抗的影响 与对照组比较,模型组血清中FBG、FINS含量及HOMA-IR明显升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组与柴胡皂苷A各剂量组上述指标显著降低(P<0.05),柴胡皂苷A不同剂量组间也具有显著差异(P<0.05);与阳性对照组比较,柴胡皂苷A低、中剂量组FBG、FINS含量与HOMA-IR均显著升高(P<0.05),柴胡皂苷A高剂量组有降低的趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3柴胡皂苷A对T2DM小鼠肝组织脂代谢相关指标的影响 与对照组比较,模型组肝组织中TG、TC、FFA含量显著增加(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组与柴胡皂苷A各剂量组肝组织中TG、TC、FFA含量显著减少(P<0.05),柴胡皂苷A不同剂量组间也具有显著差异(P<0.05);与阳性对照组比较,柴胡皂苷A高剂量组肝组织中上述指标有降低趋势,但差异不显著(P>0.05)。见表1。

表1 各组AUC、FBG、FINS含量与HOMA-IR、TG、TC、FFA含量比较

2.4柴胡皂苷A对T2DM小鼠肝组织病理学变化的影响 由HE染色结果可知,对照组肝组织结构完整,肝细胞排列有序,无病变现象。模型组肝组织结构异常,细胞排列紊乱,肝细胞出现空泡变性;柴胡皂苷A低、中剂量组肝细胞排列稍凌乱,细胞出现水肿变性情况;阳性对照组与柴胡皂苷A高剂量组细胞呈肝索状排列,未发现肝细胞水肿,少量肝细胞出现脂肪变性。见图1。

图1 各组肝组织病理(HE染色,×200)

2.5柴胡皂苷A对T2DM小鼠肝组织中PI3K/Akt通路相关蛋白表达的影响 与对照组比较,模型组肝组织中PI3K表达和p-Akt/Akt显著降低(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组肝组织中PI3K表达和p-Akt/Akt显著升高(P<0.05),柴胡皂苷A各剂量组随着剂量升高,肝组织中PI3K表达和p-Akt/Akt明显升高(P<0.05);与阳性对照组比较,柴胡皂苷A低、中剂量组肝组织中PI3K表达和p-Akt/Akt显著降低(P<0.05),柴胡皂苷A高剂量组上述指标有升高趋势,但差异不显著(P>0.05)。见图2、表2。

1～6:对照组,模型组,阳性对照组,柴胡皂苷A低、中、高剂量组图2 各组肝组织中PI3K、p-Akt、Akt表达

表2 各组肝组织中PI3K表达和p-Akt/Akt比较

3 讨 论

T2DM是一种由高血糖、胰岛素抵抗及胰岛素缺乏引起的慢性疾病,严重时引发多种器官受损,影响患者生命健康,加重社会负担〔13〕。胰岛素抵抗是T2DM的主要病理特征,是指在机体中胰岛素与其受体结合过程受阻,导致机体葡萄糖与脂质代谢紊乱,最终造成T2DM的发生〔14〕。本研究结果提示,T2DM小鼠发生胰岛素抵抗,导致肝脏受损。

中医学表示〔15〕,T2DM发生的主要病理机制为长期饮食不节导致脾虚肝郁、痰热互结。研究证实〔16,17〕,中草药在治疗T2DM过程中发挥了良好的降糖效果,有望替代副作用大的西药,成为T2DM治疗的新型药物。中药柴胡具有疏肝解郁的功效〔18〕,柴胡皂苷A作为柴胡的主要生物活性成分之一,研究证实其具有保肝护肝的作用〔19,20〕。另外有研究发现〔21〕,柴胡皂苷A对于高脂血症引起的机体损伤也具有抗炎、抗病毒作用。本研究结果提示,柴胡皂苷A能够改善胰岛素抵抗,保护肝脏。并且柴胡皂苷A高剂量组与阳性对照组比较,各个指标均有改善趋势。

PI3K/Akt信号通路在T2DM胰岛素抵抗过程中起连接作用,能够调节细胞增殖生长、糖类与脂质代谢等生理过程〔22〕。正常情况下,胰岛素与其受体结合,激活PI3K/Akt信号通路,发挥调节葡萄糖平衡的作用,改善血糖稳态和胰岛素抵抗〔23〕。本研究提示,PI3K/Akt信号通路激活受阻,导致机体内糖脂代谢异常和胰岛素抵抗;柴胡皂苷A可能通过激活PI3K/Akt信号通路,改善血糖代谢及胰岛素抵抗。

综上所述,柴胡皂苷A能够调节血糖代谢、胰岛素浓度,改善胰岛素抵抗,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。本研究结果为今后中药治疗T2DM提供了新的依据和理论基础。