脱氢表雄酮对血管性痴呆小鼠抑郁样行为的影响

张奇 宋娟 王明 田华 郭红艳 赵学梅

(齐齐哈尔医学院药学院,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

血管性痴呆(VD)是一种主要影响老年人的痴呆形式,是第二大常见痴呆类型,发病率呈逐年上升趋势,其特征是大脑供血发生变化〔1〕。研究表明,抑郁是VD中最常见的一种精神行为异常〔2〕。VD抑郁样行为会严重损害患者的身心健康,降低患者的生命质量〔3〕。目前,VD抑郁样行为的发病机制尚未完全阐明。研究发现,神经营养因子(NT)低表达是引起抑郁症状的重要原因之一,海马中NT表达的增加对抑郁症状具有改善作用。因此,调节NT表达可能是防治VD抑郁样行为途径之一〔4〕。除神经元损伤外,海马突触的损害也是VD的重要病理特征〔5〕,且海马突触可塑性的调节可以改善抑郁症状〔6〕。本实验研究脱氢表雄酮(DHEA)对VD抑郁小鼠的行为学和海马组织NT-3、脑源性神经营养因子(BDNF)和生长相关蛋白(GAP)-43表达的影响。

1 材料和方法

1.1动物 健康C57BL/6小鼠,雌雄各半,体质量18～22 g,购自辽宁长生生物技术股份有限公司,动物许可证号为SYXK(黑)2016-001。

1.2实验试剂 DHEA购自Sigma公司;抗BDNF抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;抗NF-3抗体购自Abcam公司;抗GAP-43抗体购自Proteintech公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和Ⅰ抗、Ⅱ抗去除液购自碧云天生物技术研究所;Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.3动物分组 实验前小鼠适应性喂养1 w,随机分为假手术组,模型组,DHEA低、中、高剂量组。

1.4动物模型的建立 以双侧颈总动脉闭塞(BCCAO)法建立VD小鼠模型,术前小鼠禁食12 h,自由饮水,将小鼠用0.3%戊巴比妥钠(10 ml/kg)腹腔注射麻醉,将小鼠仰卧位固定于鼠台,钝性分离胸骨舌肌与胸锁乳突肌间的肌间隙,分离双侧颈总动脉,剥离神经,暴露并夹闭双侧颈总动脉20 min后再灌注,造成全脑缺血再灌注损伤。假手术组只分离颈总动脉,不夹闭。术后,各组自由进食和饮水。

1.5给药方法 用二甲基亚砜(DMSO)溶解DHEA后,再采用植物油稀释。DHEA低、中、高剂量组缺血再灌注后,分别皮下注射20、40和60 mg/kg DHEA,假手术组和模型组给予等量植物油。

1.6悬尾实验(TST) 测试时在距小鼠尾尖约2 cm处用细绳固定悬挂在离地面20 cm处,使小鼠呈倒悬状态6 min,记录悬尾不动时间。小鼠悬尾不动时间反映其绝望水平。

1.7强迫游泳实验(FST) 第1天将小鼠依次置于水温25 ℃的玻璃容器中,玻璃容器直径15 cm,高25 cm,小鼠适应15 min后取出,擦干。第2天,在同样的条件下进行强迫游泳6 min,记录后4 min在水中游泳不动时间。游泳不动的标准为小鼠仅将头部露出水面漂浮,尾巴和前爪轻微摆动以维持身体平衡,游泳不动时间与动物绝望程度呈正相关。

1.8筑巢实验(NBT)〔7〕将小鼠单笼饲养,让其适应环境24 h后,在鼠笼内部放入约1 cm厚的垫料,垫料上放置5×5 cm2的棉花,使小鼠自由活动24 h后,拍照记录小鼠的筑巢情况,按照5分法对筑巢质量进行评分:棉花没有被撕咬计1分;较少部分棉花有被拖拽或有被撕咬行为计2分;绝大部分棉花有被拖拽到角落或有被撕咬行为计3分;3分情况下,有成型巢可见计4分;棉花被撕咬成小块,并聚拢成较深的巢计5分。

1.9Western印迹检测相关蛋白表达 将假手术组、模型组、DHEA高剂量组断头处死,暴露脑组织于冰上,用生理盐水冲洗表面残余血,立即分离出海马组织,-80 ℃保存。取小鼠海马组织匀浆液,蛋白定量采用BCA蛋白浓度测定试剂盒,将Western印迹工作液配制完成后进行蛋白质电泳、转膜,封闭液封闭1 h,加入目标蛋白和β-actin一抗,4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次。加二抗,室温下孵育2 h,TBST洗膜3次,滴加电化学发光(ECL)液,显影,定影;以β-actin为内参,检测各条带灰度值,计算目标蛋白相对表达量。

1.10统计学处理 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1DHEA对VD小鼠TST和FST的影响 与假手术组相比较,模型组TST和FST的静止时间显著增加(P<0.01),说明VD模型建立成功。与模型组相比较,DHEA低、中、高剂量组TST和FST的静止时间显著减少(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组TST和FST静止时间

2.2DHEA对VD小鼠筑巢能力的影响 与假手术组〔(4.25±0.71)分〕相比较,模型组NBT评分〔(2.88±0.64)分〕显著降低(P<0.05),说明模型小鼠自理能力显著下降。与模型组相比较,DHEA低、中、高剂量组评分〔(3.75±0.71)分、(4.00±0.76)分、(4.13±0.83)分〕显著提高(P<0.05,P<0.01)。

2.3DHEA对NT-3、BDNF和GAP-43表达水平的影响 与假手术组相比较,模型组NT-3、BDNF、GAP-43表达均显著减少(P<0.05,P<0.01);与模型组相比较,DHEA高剂量组NT-3、BDNF、GAP-43蛋白表达均显著增加(P<0.05)。见表2、图1。

表2 DHEA对VD小鼠BDNF、NT-3及GAP-43蛋白表达影响

图1 各组BDNF、NT-3及GAP-43蛋白表达

3 讨 论

VD患者常常伴随着不同程度的抑郁症状,具体表现为不愿与人沟通、情绪低落、生活自理能力下降及对较多数事物不感兴趣等〔8〕。TST、FST是常用的筛选抗抑郁药的行为学方法,而NBT是反映抑郁小鼠日常生活自理能力的行为学指标〔9〕。本实验结果显示,BCCAO小鼠较好地模拟了VD的抑郁样行为;DHEA可以减轻VD小鼠抑郁样行为,提高生活自理能力。

DHEA可以在星形胶质和大脑神经元中合成,其中DHEA在海马中含量最高,DHEA对海马发育有促进作用,还可以改变海马中的突触可塑性〔10〕。BDNF是调节突触可塑性的一种神经营养因子。临床研究显示,抑郁患者的海马发生萎缩,突触丢失,BDNF表达水平较低〔11〕。Malkesman等〔12〕研究发现,DHEA在抑郁症的神经生物学中起重要作用,DHEA可能通过调节BDNF表达水平改善抑郁症状,提高BDNF的含量可以提升受损区域相关营养蛋白表达水平,改善突触可塑性,发挥抗抑郁的作用〔13〕。NT-3也是一种重要的营养因子,可以修复损伤的突触,诱导轴突生长及促进神经元分化。Rahmani等〔14〕研究发现,NT-3间接地受到大脑中BDNF水平的影响,增加BDNF表达水平可以促进NT-3分泌。NT-3和BDNF在抑郁症的发生、发展过程中可能发挥较为重要的作用。本实验结果提示,DHEA对VD小鼠抑郁样行为的改善作用机制可能与调节NT表达有关。

脑血管病变可引起局部或全脑供血不足,导致损伤脑组织,是VD发生的主要病因。脑组织对缺血极其敏感,尤其是海马组织,缺血导致海马突触发生变性和丢失,同时也会改变突触相关蛋白表达水平,进而影响突触可塑性;突触生长受突触相关蛋白所调控,其蛋白表达水平的改变会导致抑郁和焦虑等精神行为异常的发生〔15〕。突触小泡蛋白(SYP)不仅影响突触结构,而且还可以通过调节神经递质的释放,进而影响突触可塑性。突触后致密蛋白(PSD)-95位于突触后致密区,含量丰富,它在谷氨酸受体动力学的过程中发挥重要作用,从而在突触的功能和可塑性中起重要作用。GAP-43被认为是突触生长的标志物,在神经系统损伤的过程中,GAP-43高表达可对轴突生长起促进作用〔16〕。前期的研究〔17〕发现,DHEA可以上调VD小鼠SYP和PSD-95等突触相关蛋白表达水平。本实验结果提示,DHEA显著增加了VD小鼠海马组织中GAP-43表达,DHEA对VD小鼠抑郁样行为的改善作用机制可能与调节突触相关蛋白表达有关。

综上所述,DHEA可通过上调NT-3、BDNF和GAP-43蛋白的表达,调节VD小鼠NT的表达,提高突触的可塑性,发挥其改善VD抑郁样行为的作用。