小白菊内酯通过LINC00299/miR-590-3p对阿尔茨海默病模型细胞损伤的影响

王进 霍颖浩 樊登云 殷立新

(河北医科大学第二医院 1药学部,河北 石家庄 050000;2神经内科)

细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和细胞内神经原纤维缠结的形成是阿尔茨海默病(AD)的主要病理特征〔1〕。Aβ是体内新陈代谢产物,其过度积累可促进线粒体分裂,破坏线粒体膜电位,增加细胞内活性氧水平,促进细胞氧化应激和凋亡〔2〕。目前,虽然对AD的诊断和治疗给予极大关注,但预防AD发展策略仍然有限。小白菊内酯是一种倍半萜稀内酯类化合物,具有抗炎、抗癌和免疫调节活性等药理作用〔3〕。研究表明,小白菊内酯可影响小鼠帕金森病模型黑质中炎症因子环氧合酶(COX)-2及其产物的表达进而对多巴胺能神经元起到保护作用〔4〕。小白菊内酯还可保护神经细胞免受糖氧剥夺诱导的凋亡和氧化应激〔5〕。研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)等ncRNA与AD的发病机制有关,是AD治疗、诊断和预防的潜在靶点。AD患者中miR-590-3p表达降低〔6〕。过表达miR-590-3p可减弱1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞线粒体功能障碍和氧化应激〔7〕。DIANA预测到miR-590-3p可能是LINC00299的潜在靶点。已有研究显示,敲减LINC00299可改善氧化型低密度脂蛋白诱导的人主动脉平滑肌损伤〔8〕。但小白菊内酯是否调控LINC00299/miR-590-3p对AD细胞损伤发挥保护作用并不清楚。本研究拟以Aβ1～42诱导SK-N-SH复制AD细胞损伤模型〔9〕,探讨小白菊内酯对AD模型细胞损伤的保护作用,并评估其机制是否与调控LINC00299/miR-590-3p通路相关。

1 材料与方法

1.1实验材料 人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购自中国科学院上海细胞库;小白菊内酯(纯度≥98%,货号B21375)购于上海源叶生物;Aβ1～42购自美国Sigma-Aldrich公司;荧光素酶报告载体、pcDNA-RNA、si-RNA、miRNA mimics购于广州锐博生物公司;cDNA逆转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司;实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购于北京百奥莱博生物公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒、细胞计数试剂盒(CCK-8)购于福州飞净生物公司;丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购于北京索莱宝生物公司;羊抗鼠IgG二抗,鼠源磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)单克隆抗体购于美国Santa Cruz公司。

1.2细胞培养、转染和实验分组 SK-N-SH细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。用5 μmol/L的Aβ1～42作用于SK-N-SH细胞24 h复制AD细胞模型〔9〕,记为模型(Model)组。利用脂质体Lipofectamine2000分别将si-NC、si-LINC00299、pcDNA、pcDNA-LINC00299转染SK-N-SH细胞,转染48 h后收集细胞进行后续实验。分别用含5 μmol/L的Aβ1～42和10、20、50 μmol/L小白菊内酯〔10〕培养液孵育SK-N-SH细胞,分别记为Model+小白菊内酯低剂量(Parthenolide-L)组、Model+Parthenolide-中剂量(M)组、Model+Parthenolide-高剂量(H)组。用含5 μmol/L的Aβ1～42和50 μmol/L 小白菊内酯培养液孵育转染pcDNA-LINC00299、转染pcDNA细胞,分别记为Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299组、Model+Parthenolide-H+pcDNA组。Con组为正常培养的SK-N-SH细胞。

1.3RT-qPCR检测LINC00299和miR-590-3p表达 Trizol法提取细胞总RNA,逆转录后,采用一步法荧光定量PCR试剂盒进行RT-qPCR。2-ΔΔCt法评估LINC00299(内参为GAPDH)和miR-590-3p(内参为U6)表达量。

1.4CCK-8法检测SK-N-SH细胞活力 将转染或未转染细胞以每孔2×103个/100 μl的密度接种于96孔板,按照上述分组加入含不同浓度小白菊内酯或(和)5 μmol/L的Aβ1～42的培养液,24 h后,加入CCK-8工作液孵育2.5 h。酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)以评估细胞活力。

1.5流式细胞术检测SK-N-SH细胞凋亡率 用500 μl 1×结合缓冲液(含5 μl Annexin Ⅴ-FITC和10 μl PI)在暗室孵育SK-N-SH细胞15 min。流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.6SK-N-SH细胞中MDA含量、SOD和LDH活性检测 SK-N-SH细胞处理完毕后,分别收集细胞培养液和细胞。使用LDH活性试剂盒检测培养液中的LDH活性。同时,向含有SK-N-SH细胞沉淀的离心管中加入1 ml提取液,超声波破碎细胞,超低温离心机(10 000 r/min)离心10 min收集上清液,采用MDA、SOD、MDA试剂盒测定。

1.7Western印迹检测SK-N-SH细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达 RIPA法提取蛋白。按照每泳道50 μg加载蛋白,设置电压100 V、时间120 min进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。设置电流20 mA转膜过夜。膜封闭后,用鼠源GAPDH、Bcl-2或Bax一抗孵育膜2 h,再用羊抗鼠酶标二抗孵育膜1 h。将膜置于孵育盒内,加入化学发光显色液进行显色反应。ImageJ软件分析目的条带相对灰度值。

1.8双荧光素酶报告实验验证LINC00299和miR-590-3p靶向关系 合成LINC00299野生型(WT)序列(包含miR-590-3p结合位点)或LINC00299突变型(MUT)序列(含有miR-590-3p突变位点)并分别插入pmirGLO载体WT-LINC00299、MUT-LINC00299。将这些载体与miR-590-3p mimic或miR-NC共转染至SK-N-SH细胞。转染48 h测定相对荧光素酶活性。

1.9统计学分析 采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH损伤的影响 与Con组比较,Model组SK-N-SH细胞LINC00299表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高,miR-590-3p表达量、细胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05);与Model组比较,Model+Parthenolide-M组、Model+Parthenolide-H组SK-N-SH细胞LINC00299表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量显著降低,miR-590-3p表达量、细胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表达量显著升高(P<0.05);与Model+Parthenolide-M组比较,Model+Parthenolide-H组SK-N-SH细胞LINC00299表达量、凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(P<0.05),miR-590-3p表达量、细胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。见图1、表1、图2。

表1 小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH损伤的影响

2.2小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH氧化应激的影响 与Con组比较,Model组SK-N-SH细胞MDA含量、LDH释放量显著增加,SOD活性显著降低(P<0.05);与Model组比较,Model+Parthenolide-M组、Model+ Parthenolide-H组SK-N-SH细胞MDA含量、LDH释放量显著降低,SOD活性显著升高(P<0.05);与Model+Parthenolide-M组比较,Model+Parthenolide-H组MDA含量、LDH释放量显著降低,SOD活性显著升高(P<0.05)。见表2。

1～7:Con组、Model组、Model+Parthenolide-L组、Model+Parthenolide-M组、Model+Parthenolide-H组、Model+Parthenolide-H+pcDNA组、Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299组图2 各组Bax、Bcl-2蛋白表达

表2 小白菊内酯减轻Aβ1～42诱导的SK-N-SH细胞氧化应激

2.3过表达LINC00299可逆转小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH损伤的影响 与Model+Parthenolide-H+pcDNA组比较,Model+ Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299组SK-N-SH细胞LINC00299表达量、凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高,miR-590-3p表达量、细胞活力(OD值)、Bcl-2蛋白表达量显著降低(P<0.05)。见图2、图3、表3。

图3 LINC00299可逆转小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH凋亡的影响

表3 LINC00299可逆转小白菊内酯对Aβ1～42诱导的SK-N-SH细胞损伤

2.4过表达LINC00299可逆转小白菊内酯对Aβ1～42处理SK-N-SH氧化应激的影响 与Model+Parthenolide-H+pcDNA组MDA含量、LDH释放量、SOD活性〔(44.29±1.98)nmol/ml、(163.48±11.66)U/L、(274.46±11.07)U/L〕比较,Model+Parthenolide-H+pcDNA-LINC00299组SK-N-SH细胞MDA含量〔(100.44±4.49)nmol/ml〕、LDH释放量〔(290.04±4.19)U/L〕显著增加,SOD活性〔(135.92±5.15)U/L〕显著降低(t=19.819、17.692、19.654,均P=0.000,n=3)。

2.5LINC00299靶向miR-590-3p DIANA工具预测到miR-590-3p与LINC00299序列间存在互补结合位点。见图4。转染miR-590-3p mimic后细胞中WT-LINC00299的相对荧光素酶活性(0.13±0.01)与转染miR-NC(1.01±0.07)比较显著降低(t=21.566,P=0.000)。而转染miR-590-3p mimic后细胞中MUT-LINC00299的相对荧光素酶活性(0.97±0.05)与转染miR-NC(0.99±0.07)无统计学差异(P>0.05)。

图4 LINC00299和miR-590-3p的互补序列

3 讨 论

小白菊内酯是草本植物艾菊的主要活性成分,广泛用于治疗发热、偏头痛、关节炎和浅表炎症,临床应用安全性高。Wang等〔11〕采用脑卒中模型证实小白菊内酯可抑制促炎因子分泌、抵抗氧化应激、减少凋亡。有研究〔12〕发现,小白菊内酯通过促进M2小胶质细胞/巨噬细胞极化可缓解神经疼痛。Tao等〔13〕指出,小白菊内酯还可促进轴突再生,增加髓鞘重建,减少硫酸软骨素的形成,抑制瘢痕增生,调节M1/M2极化促进脊髓损伤修复。以上研究表明,小白菊内酯具有潜在的神经保护作用。本研究发现,中、高剂量的小白菊内酯处理可有效提高Aβ1～42诱导的SK-N-SH细胞活力、SOD活性,抑制细胞凋亡和LDH释放,降低MDA含量。同时,小白菊内酯还上调Bcl-2蛋白、下调Bax蛋白表达。Aβ过度积累可增加细胞内活性氧水平,当活性氧生成大于SOD等抗氧化酶的清除能力时可促进脂质过氧化,进而导致终产物MDA生成及细胞损伤标志物LDH释放〔14〕。Bax细胞内重要促凋亡蛋白,其上调可转位到线粒体膜,改变线粒体膜电位等一系列凋亡促进因子释放进而加剧细胞凋亡,抗凋亡蛋白Bcl-2通过结合Bax起着相反作用〔15〕。以上结果表明,小白菊内酯减弱了Aβ1～42诱导的SK-N-SH细胞凋亡和氧化应激。

lncRNA和miRNA是类内源性RNA转录本,其通过调控细胞生理过程,参与包括AD在内多种人类疾病进展。如抑制lncRNA核富集转录体(NEAT)1通过负调控miR-107表达可抑制AD模型细胞凋亡〔16〕。本研究中Aβ1～42处理显著增加SK-N-SH细胞中LINC00299表达,降低miR-590-3p表达,而小白菊内酯处理显著减弱Aβ1～42对LINC00299和miR-590-3p表达的影响,提示小白菊内酯对AD模型细胞保护作用可能与调控LINC00299和miR-590-3p表达相关。有研究指出,动脉粥样硬化患者LINC00299表达增加,抑制LINC00299表达可抑制血管平滑肌细胞和血管内皮细胞增殖和迁移,并改善氧化型低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞氧化损伤〔17,8〕。深入分析发现,miR-590-3p是LINC00299的直接靶点,提示可能存在LINC00299/miR-590-3p轴。过表达LINC00299显著逆转小白菊内酯对Aβ1～42诱导SK-N-SH细胞凋亡、氧化应激及miR-590-3p表达的影响,表明小白菊内酯可能通过调控LINC00299/miR-590-3p途径对AD模型细胞发挥保护作用。

综上,小白菊内酯可减弱Aβ1～42诱导的SK-N-SH细胞损伤,其机制可能与调控LINC00299/miR-590-3p途径相关,丰富了小白菊内酯的神经保护作用机制。