鹿茸多肽对肾阳虚证心肌损伤大鼠心肾功能的保护作用

郑彭予 肖静 黎清俊羽 王阁 律广富 王雨辰 林喆 徐岩 黄晓巍,4

(1长春中医药大学药学院临床药学与中药药理教研室,吉林 长春 130117;2中国医学科学院药用植物研究所;长春中医药大学 3吉林省人参科学研究院中药药理组;4东北亚中医药研究院基础研究所)

心血管疾病已成为全球最常见的死因之一〔1〕,且心肌细胞属于终末分化的细胞不能再生。所以,防止心肌细胞损伤和丢失是现代医学的治疗策略〔2〕,在医疗领域也是一项重大挑战。中医学认为,肾主水,心肾相通,心肾阳虚是导致心肌损害的主要病机,心阳不足,久病累及肾脏,导致肾脏元阴元阳受损,阳虚不振,阴虚不振,或肾阳不足,气化不足,水气逆心,导致心力衰竭,故名曰:“补心,固肾,固心,固心”。从心肌损害的临床特征来看,心肾阳虚为其病理学基础,但目前尚无有效的治疗方法〔3〕。治疗该病的要点是“温阳逐水”“活血化瘀”“通心肾”,阳气充盛,则水气运行顺畅,五脏才能正常行使其生理功能。心肾阳虚证临床上最常见的症状是心悸、水肿等。心虚胆小、心血亏损、痰阻心脉、水饮逆心、心阳虚损是中医辨证的基本特征。中医学认为,心阳能下通肾水,肾阴能上通心阳。因此,在治疗心脑血管疾病时,如有畏寒肢冷、面色苍白等阳气不足之症,常以鹿茸为药,以温肾阳,扶心阳。

鹿茸主要活性成分鹿茸多肽(VAP)具有促进成骨、造血、神经、表皮和毛发生长的作用,而且还含有大量表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等多种细胞生长因子,可以在抗氧化、抗炎、抗癌、心肌保护、肾脏保护等多个方面发挥防治作用〔4〕。本课题组前期研究发现〔5〕,VAP对阿霉素所致的心肌损伤大鼠有不同程度的保护作用,但VAP能否改善肾阳虚证下心肌损伤模型大鼠的心肾功能尚不明确。本研究拟探索VAP对肾阳虚证下心肌损伤模型大鼠心肾功能的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器 48只SPF级12周龄雄性健康SD大鼠,体质量180～200 g,均购自长春亿斯科技有限公司,动物生产许可证号:SCXK-(吉)-2022-0002。VAP(长春中医药大学药学院制备,每1 g VAP约含生药鹿茸28.9 g,批号:20221020),氢化可的松注射液(山西芮城县红宝兽医有限责任公司,批号:2202121),盐酸贝那普利片(北京诺华制药有限公司,批号:2207A06),Protein Marker(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P0068),苏木素-伊红(HE)染液、依文思蓝(北京索莱宝科技有限公司,货号:D1120、E8010),丙二醛(MDA)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:A003-2-2、A001-3-1、A020-2-1),环磷酸腺苷(cAMP)检测试剂盒、磷酸肌酸同工酶(CK-MB)检测试剂盒、环磷酸鸟苷(cGMP)检测试剂盒(江苏酶免实业有限公司,货号:A003-4-1、H197-1-1、A020-2-1),转化生长因子(TGF)-β1、VEGF抗体、缺氧诱导因子(HIF)-1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,货号:69012-1-Ig、19003-1-AP、20960-1-AP),超纯水制备系统(四川沃特尔科技发展有限公司,型号:WP-RO-40B),光学显微镜(日本OLSMPUS公司,型号:Gallios),超低温冰箱(美国Thermo公司,型号:ULT1386-3-V41),多道生理记录仪(埃德仪器国际贸易有限公司,型号:ML224),离心机(德国艾本德股份公司,型号:Centrifuge 5810 R),恒温培养箱(EYEL4公司,型号:SLI-700),荧光发光凝胶成像系统(英国UVItec公司,型号:Q9-Alliance),多功能微孔板酶标仪(美国赛默飞世尔有限公司,型号:SUNERGY-HTX),电泳仪、电泳槽(美国伯乐Bio-Rad公司,型号:BE6085)。

1.2实验动物分组及模型制备 大鼠自由进食和饮水,饲养环境:12 h光/暗循环、恒温(23～25 ℃)、恒湿(40%～70%),适应性饲养1 w。采用随机平行对照分配法将48只大鼠分为空白组、模型组、阳性药组〔盐酸贝那普利片0.5 mg/(kg·d)〕、低、中、高剂量VAP组〔100、200、300 mg/(kg·d)VAP〕。除空白组外,各组肌肉注射氢化可的松25 mg/(kg·d),1次/d,连续肌注21 d,同时腹腔注射阿霉素2.2 mg/(kg·d),复制肾阳虚证下心肌损伤大鼠模型。造模结束后以大鼠体征变化、心电图ST段明显升高为模型成功判断标准。造模成功后连续给药28 d。阳性药组灌胃右归丸600 mg/(kg·d)和酒石酸美托洛尔片20 mg/(kg·d),不同剂量VAP组灌胃相应剂量VAP,空白组、模型组灌胃相等体积蒸馏水。末次给药2 h后,麻醉大鼠进行腹主动脉取血,将每只大鼠血清低温-80 ℃保存备用。

1.3各组体征监测 观察大鼠体质量、食欲、大便、毛发的光泽度、活动度、精神状态等并做记录。

1.4各组心电图检测 以戊巴比妥钠(30 mg/kg)作为麻醉药物腹腔注射,在大鼠失去翻正反射时将大鼠与心电图处理系统相连进行测量。

1.5HE染色观察各组心肌组织及肾脏组织纤维化和微血管损伤情况 将各组大鼠处死后,取出心脏及肾脏,用生理盐水漂洗,使用4%多聚甲醛进行固定后分别加入不同浓度酒精梯度脱水,再使用二甲苯进行透明处理,最后用石蜡包埋制成石蜡切片。经过HE染色,中性树脂封片,在显微镜下观察其纤维化和微血管损伤情况改变表现并拍照记录。

1.6生化法检测各组血清SOD活性、LDH和MDA水平 按照试剂盒说明书方法步骤分别检测大鼠血清生化指标SOD活性、LDH和MDA水平。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清cAMP、cGMP和CK-MB水平 按照ELISA试剂盒说明书步骤进行。

1.8Western印迹检测各组肾脏组织中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平 按照常规方法提取各组肾脏组织蛋白,检测VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组体征 空白组眼睛有神,动作敏捷,毛发光泽浓密,紧贴躯体,食量和排泄均正常;模型组出现两眼无神,精神萎靡,行动迟缓,活动耐力下降,皮毛干枯易脱落,相互扎堆,足背水肿,体质量下降,食欲不振,尿量减少等肾阳虚证特征性表现;阳性药组和高剂量VAP组一般状态接近于正常组。与空白组比较,模型组体质量增长速度明显降低(P<0.01);与模型组比较,阳性药组、中和高剂量VAP组体质量增长速度明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 各组体质量比较

2.2各组心电图检测 除空白组外,其他实验组ST段均明显升高;与模型组比较,阳性药组,低、中和高剂量VAP组ST段明显降低。见图1。

图1 各组心电图

2.3各组血清SOD活性、LDH和MDA水平比较 与空白组比较,模型组血清SOD活性明显降低,LDH和MDA水平明显升高(P<0.01);与模型组比较,阳性药组、中、高剂量VAP组血清中SOD活性明显升高,LDH和MDA水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表2。

2.4各组血清cAMP、cGMP和CK-MB水平与空白组比较,模型组血清cGMP水平明显升高,cAMP和CK-MB水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,阳性药组、中、高剂量VAP组cGMP水平明显降低,cAMP和CK-MB水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表2。

表2 各组血清SOD活性、LDH和MDA水平及cGMP、cAMP和CK-MB水平比较

2.5各组心肌组织病理形态表现 HE染色结果显示,与空白组比较,模型组心肌纤维排列混乱,纤维化明显,有大量炎症细胞浸润,间隔变大;与模型组比较,阳性药组、中、高剂量VAP组心脏组织侵袭及纤维化程度均明显降低。见图2。

2.6各组肾脏组织病理形态表现 HE染色结果显示:与空白组比较,模型组肾组织结构异常,部分肾小管上皮细胞萎缩,管腔扩张,如黄色箭头所示;部分肾小球萎缩,毛细血管袢结构不清晰,如红色箭头所示;间质可见纤维组织及炎症细胞增生,如黑色箭头所示;与模型组比较,阳性药组、中剂量VAP组和高剂量VAP组肾小球萎缩,纤维化及炎症细胞均有所减轻。见图2。

图2 各组心肌、肾脏组织病理形态(HE染色,×200)

2.7各组肾脏组织中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平比较 与空白组比较,模型组肾脏组织中HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平明显升高,VEGF蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,阳性药组和中、高剂量VAP组肾脏组织中HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01),低剂量组VAP组HIF-1显著降低(P<0.01),阳性药组和中、高剂量VAP组VEGF蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。见表3、图3。

表3 各组肾脏组织中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表达水平

1～6:空白组,模型组,阳性药组,高、中、低剂量VAP组图3 各组肾脏组织中VEGF、HIF-1和TGF-β1表达

3 讨 论

无论在发展中国家还是在发达国家,心血管疾病发病率均不断攀升〔6〕。针对冠心病、高血压等多种心脑血管疾病,目前尚无有效防治药物。大部分植物产物作为药材可以发挥其保护效益,通过降低机体内氧化应激反应和脂质过氧化作用,恢复钙离子平衡,减少心肌损伤标志物和促炎细胞因子表达,调节凋亡水平下降来修复及保护心肌损伤〔7～9〕。而鹿茸作为动物药含有多种血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂,可对心血管系统产生更加积极的作用进而有益于健康〔10〕。研究表明〔11〕,鹿茸能够升高心肌损伤后大鼠血管内皮细胞生长因子的含量,从而促进血管生成并对血管内皮细胞损伤进行修复,具有抗氧化应激、抗炎、抗凋亡、清除组织自由基、减少体内毒素蓄积、延缓神经组织纤维化进程、抑制炎症因子和神经保护功能等作用,进而保护肾脏损伤。心肌缺血后,机体迅速生成大量自由基,过多自由基是造成心脏损害的主要原因,氧化自由基的清除可以通过两种方式进行:(1)直接提供电子,还原氧自由基;(2)对氧自由基进行及时清除,使体内抗氧化酶活性得到提高。SOD是一种十分重要的氧自由基清除剂,可以将氧自由基彻底清除进而保护机体不受损伤〔12,13〕。CK-MB是判断心肌损伤程度的主要指标。LDH在各种组织中均有表达,以心脏和肾为最高,是一种普遍判断心病及肾病的指标〔14〕。本研究结果显示,VAP治疗肾阳虚证心肌损伤大鼠可显著改善其心肌及肾脏功能。近年来研究发现〔15,16〕,细胞内cGMP的增加会使心肌细胞自律性下降。本研究结果提示,VAP可显著改善肾阳虚证心肌细胞的凋亡,保护大鼠心肌功能。研究表明〔17〕,激活cAMP信号途径可以对心肌起到保护作用,cAMP可以释放具有活性的亚基,并将其转移到细胞核中。也有研究证明〔18,19〕,cAMP的激活可以减轻因各种理化因素导致的心肌细胞凋亡。本研究结果提示VAP可显著改善肾阳虚证心肌损伤大鼠的心肌功能,发挥心脏保护作用。肾组织中有丰富的间质-肌成纤维细胞,而TGF-β1可调控成纤维细胞活化,当肾阳虚证大鼠心脏损伤后,肾脏TGF-β1蛋白水平高表达,肾脏纤维化程度明显升高,且随损伤程度增加而升高,是导致肾阳虚大鼠肾脏纤维化的重要原因〔20～22〕。本研究结果表明,VAP可以通过降低TGF-β1蛋白表达对大鼠肾脏发挥保护作用。VEGF是一种多功能肝素结合糖蛋白,可以促进内皮细胞的有丝分裂和迁移,起到抗凋亡作用,还可以参与新生血管生成〔23,24〕。研究表明〔25～27〕,在肾脏发生纤维化时,VEGF表达显著降低,与肾脏发生微循环障碍时相似。在肾脏损伤进程中,由于血液流量降低,肾小管上皮细胞出现HIF-1,导致肾脏内皮稳态失衡。本实验结果表明,HIF-1对VEGF的表达不利。本研究表明VAP可以改善肾纤维化中的微血管损伤。VAP可以影响肾阳虚证心肌损伤大鼠肾脏中HIF-1和VEGF蛋白表达水平来改善肾脏损伤。

综上,用不同浓度VAP治疗后,肾阳虚证下心肌损伤大鼠的宏观体征及客观指标等均有不同程度改善,且其作用效果与VAP剂量相关。其治疗肾阳虚证心肌损伤大鼠可能通过抗氧化应激、抗炎、抗凋亡、纠正体内自由基紊乱、调节cAMP、cGMP通路来减轻心肌及肾脏损伤、介导TGF-β1通路来调控成纤维细胞活化,使肾脏纤维化程度减轻和HIF-1与VEGF之间相互调节来保护心脏及肾脏的微血管损伤。然而,肾阳虚证心肌损伤的机制比较复杂,其中涉及的信号通路及蛋白并不是单独作用,而是多条通路相互配合发挥治疗作用。因此VAP发挥治疗肾阳虚证心肌损伤的作用机制还有待进一步研究。