基于炎症反应研究参苓白术散加减方治疗溃疡性结肠炎的药效及作用机制

邓永文 张全辉 陈教华 张磊昌

(江西中医药大学附属医院,江西 南昌 330006)

溃疡性结肠炎(UC)病变以结直肠多见,且病程较长,易反复发作,具有一定的癌变风险,给患者生活质量带来严重影响〔1,2〕。中医学认为,UC属“下痢”“泄泻”“赤白痢”等范畴,脾气虚弱、运化失调是本病主要病机,因此UC治疗通常采用健脾益气、渗湿止泻为主〔3,4〕。近年来,参苓白术散开始用于治疗UC患者,临床疗效理想〔5,6〕。研究表明,采用参苓白术散治疗UC小鼠可明显改善其结肠黏膜损伤程度并降低疾病活动指数(DAI)及血清炎性因子含量,下调结肠组织中髓过氧化酶活性和丙二醛含量〔7〕。研究证实,通过参苓白术散治疗脾虚湿热性UC患者,可显著缓解其腹痛腹泻、黏液脓血便、食少腹胀等症状,临床效果确切〔8〕。然而关于参苓白术散作用机制不甚明确,故本研究旨在探究参苓白术散加减方对UC结肠黏膜损伤的修复作用及对UC发病过程中炎症反应的影响,并进一步阐释该方对UC的保护作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 30只Balb/c小鼠(雌雄各半)购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司,生产批号:SCXK(苏)2018-0001,体质量20～22 g。将30只Balb/c 小鼠置于SPF级动物房中进行适应性喂养,分笼饲养,每笼5只,室温控制于20～25 ℃,湿度为55%～60%,均自由摄食及饮水。

1.2主要试剂 试剂:聚偏氟乙烯(PVDF)膜(武汉爱博泰克公司);TriZol(深圳市益百顺公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量检测试剂盒(广州一科公司);白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α抗体(广州永诺公司);β-actin抗体(广州苏玛生物公司);凝胶制备试剂盒(北京绿源大德公司);电化学发光(ECL)液(北京兰博利德公司);酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(北京强欣博瑞公司);放射免疫沉淀裂解液(RIPA,深圳市文乐公司);逆转录试剂盒(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3药物制备 参苓白术散加减方由山药、薏苡仁、炒谷芽、炒麦芽 20 g,党参、茯苓、白及、六月霜、炒枳壳 15 g,炒白术、陈皮、桔梗、炒扁豆 10 g,砂仁(后下)、炙甘草、黄连6 g构成。在16味药物中加入8倍量水浸泡,30 min后进行煎煮,共3次,然后将3次煎液合并滤过并减压,使其浓缩至1 000 ml。试验药物剂量设置依据:2015年版《中华人民共和国药典》。

1.4分组、建模及药物治疗 随机抽取6只Balb/c小鼠作为空白对照组,余24只小鼠通过饮用3%葡聚糖硫酸钠(DSS)建立UC小鼠模型,连续饮用8 d。建模后随机抽取6只UC小鼠作为模型对照组,余18只UC小鼠模型分为参苓白术散加减方低、中、高剂量组,每组6只,其中参苓白术散加减方低、中、高剂量组分别予以7.8、15.6、31.2 g/kg参苓白术散加减方(200 μl)灌胃,连续灌胃12 d,另外两组均通过等体积蒸馏水灌胃处理。

1.5DAI计算 观察各组体质量、腹泻和便血等体征并计算其DAI,计算方法为,0分:大鼠体质量未下降,大便性状正常,便血为隐血(-);1分:体质量下降1%～5%,大便性状介于正常与松散之间,便血介于隐血(-)与隐血(+)之间;2分:体质量下降6%～10%,大便性状松散,便血为隐血(+);3分:体质量下降11%～20%,大便性状介于松散与稀便之间,便血介于隐血(+)与肉眼血便之间;4分:体质量下降>21%,大便性状为稀便,便血为肉眼血便。

1.6小鼠结肠病理组织学分析 分析各组小鼠结肠黏膜大体形态。将各组小鼠麻醉并断颈处死,取其盲肠至肛门段结肠,经测量后取每段结肠末端部分通过10%甲醛溶液固定,观察各组小鼠粘连程度、炎症及溃疡形成情况。

1.7小鼠血清炎性因子水平分析 于小鼠眼球取血,经台式高速低温离心机以1 500 r/min的速度离心后取上层血清,然后通过ELISA试剂盒检测相关因子水平,稀释提前制备好的样品及对照品,并加入检测抗体,在37 ℃环境下孵育1 h,然后通过ELISA洗板液洗板5次,将底物A、B置于其中,随后放在37 ℃环境下避光反应15 min后终止。通过酶标仪于450 nm波长处测定相关吸光度。

1.8免疫组化法检测小鼠结肠组织中细胞核增殖抗原(Ki-67)表达 分离小鼠结肠组织并将其固定在4%多聚甲醛,石蜡包埋切片后烘烤切片,放入二甲苯脱蜡至水,经梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脱水后通过柠檬酸钠热修复抗原,完成上述操作后将切片置于3%H2O2,然后通过正常山羊血清封闭液封闭,经一抗、二抗孵育后通过链霉亲和素-过氧化物酶复合物(POD)孵育组织,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染封片,最后分析Ki-67表达情况。

1.9实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测小鼠结肠组织中炎性因子表达分析 通过TriZol裂解法提取结肠组织中总RNA并检测其浓度,随后于20 μl体系中实施逆转录反应,反应产物于70 ℃变性10 min并保存于-20 ℃。PCR:2 μl逆转录产物,5 μl Taqmix,0.5 μl上游引物(10 μmol/L),0.5 μl下游引物(10 μmol/L),2.0 μl灭菌双蒸水。条件:首先94 ℃预变性2 min;然后94 ℃变性30 s,55～62 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共30个循环;最后72 ℃延伸5 min。引物序列由广州沛瑜公司合成,引物序列:IL-6:上游5′-AGCCCACCAAGAACGATAG-3′、下游5′-GGTTGTCACCAGCATCAGT-3′,IL-1β:上游5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′、下游5′-TGTGCTGCGAGATTTGA-3′,TNF-α:上游5′-GAT-CGGTCCCCAAAGGGATG-3′、下游5′-TTGCTACGAC-GTGGGCTACA-3′,β-actin:上游5′-GCACCATGAAG-ATCAAGATCATT-3′、下游5′-TAACAGTCCGCCTAG-AAGCATT-3′。以β-actin作内参。电泳后观察、拍照并分析。

1.10Western印迹检测小鼠结肠组织中炎性因子表达 取小鼠结肠组织通过RIPA裂解,随后对提取的总蛋白浓度进行检测,浓度检测完成后将其置于室温下自然融化。根据实验设计依次将样品置于上样孔,然后连接电源实施电泳,并转至PVDF膜,置于5%脱脂牛奶中行封闭处理。加一抗、二抗孵育后洗膜,并通过化学发光法进行胶片曝光,显影、定影后分析目标蛋白IL-6、IL-1β、TNF-α表达量。

1.11统计学方法 采用SPSS22.0软件进行方差分析,两组间比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1各组DAI评分比较 模型对照组DAI较空白对照组明显升高(P<0.05);与模型对照组比较,参苓白术散加减方高剂量组DAI明显降低(P<0.05)。见表1。

2.2各组结肠病理组织学分析 模型对照组形态损伤评分较空白对照组明显升高(P<0.05);参苓白术散加减方中、高剂量组形态损伤评分均较模型对照组明显降低(P<0.05)。见表1。

2.3各组血清炎性因子水平比较 模型对照组血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均较空白对照组明显升高(P<0.05);参苓白术散加减方高剂量组血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均较模型对照组明显降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组DAI评分、形态损伤评分、血清炎性因子水平比较

2.4各组结肠组织形态变化分析 空白对照组结肠组织腺体结构完整,未出现损伤;模型对照组结肠组织发生明显受损,腺体破碎,且黏膜层损伤严重,出现充血及水肿,炎性细胞浸润;参苓白术散加减方低、中剂量组结肠组织中可见肉芽组织增生,腺体结构受损,炎性细胞浸润;参苓白术散加减方高剂量组出现少量炎性细胞浸润,偶见组织水肿及充血。图1。

图1 各组结肠组织形态学(免疫组化,×100)

2.5各组结肠组织中Ki-67表达比较 模型对照组结肠组织中Ki-67表达较空白对照组明显升高(P<0.05);参苓白术散加减方高剂量组结肠组织中Ki-67表达较模型对照组明显降低(P<0.05)。见表2。

2.6各组结肠组织炎性因子表达比较 模型对照组结肠组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表达量均较空白对照组明显升高(P<0.05);参苓白术散加减方高剂量组结肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表达量均较模型对照组明显降低(P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组Ki-67表达、结肠组织炎性因子mRNA及蛋白表达比较

1～5:空白对照组、模型对照组、参苓白术散加减方低、中、高剂量组图2 各组结肠组织炎性因子蛋白表达

3 讨 论

UC在任何年龄段均可发病,尤以20～40岁患者为最多,且该病病程较长,易反复发作,存在癌变的可能〔9〕。一项调查数据显示,我国UC患病率约为11.6/105,然而由于人们饮食结构、生活习惯变化及医疗技术的不断进步,本病患病率呈逐年增加趋势,给患者及家庭带来沉重负担〔10,11〕。目前研究认为UC发病可能与感染、免疫及精神等因素密切相关,然而关于本病发生的病因及机制尚未完全阐明〔12〕。近年来,中医药在治疗UC方面取得较大的进展,其已被证实可有效改善UC患者临床症状,延缓病情进展,提高患者生存质量。参苓白术散可发挥益气健脾、渗湿止泻之功效,其已被证实可有效提高胃肠动力并促进胃肠黏膜屏障修复〔13〕。闫文慧等〔14〕报道显示参苓白术散加减方中的活性成分可明显抑制UC患者肠黏膜炎症细胞浸润,有利于缓解黏膜损伤程度。朱磊等〔15〕研究通过建立UC大鼠模型并予以其参苓白术散加减方干预,发现UC大鼠模型血清中IL-5、IL-6等炎性因子含量降低,IL-4等抑炎因子含量升高,在改善UC大鼠症状方面具有一定效果。提示,参苓白术散加减方可在一定程度上改善UC小鼠病情严重程度及结肠组织损伤情况。这与毕殿勇等〔16〕研究结果基本一致。

Ki-67在分辨生长中的正常细胞及癌细胞中具有重要价值,张慧等〔17〕发现,在正常组织内Ki-67并未出现表达,然而其在肿瘤组织及增殖的细胞核中表达出现异常,尤其是前者,除此之外该研究亦发现,其在UC组织及结肠癌组织中含量无明显差异。本研究结果发现,UC小鼠模型结肠组织中Ki-67表达明显增加,而经参苓白术散加减方干预后UC小鼠结肠组织中Ki-67表达明显降低。毕殿勇等〔16〕报道显示,细胞因子失衡在UC发生过程中发挥关键作用,UC患者出现肠黏膜损伤,主要是由于患者体内促炎因子含量超过抑炎因子含量,进而引发机体组织损伤。、IL-1β、IL-6、TNF-α作为促炎因子,在UC发生过程中大量释放,可引发肠过度炎症反应,进而导致结肠组织水肿、出血、坏死等〔16〕。袁星华〔18〕报道显示,UC患者血清中IL-6、TNF-α含量均较健康人群显著升高,且其含量与UC进展呈正相关。唐舒婷等〔19〕报道显示,UC患者血清、肠道黏膜及肠道平滑肌中IL-1β含量均明显上调,其可导致患者平滑肌功能发生变化,进而引发结肠平滑肌细胞对神经激肽A的收缩作用显著减弱,此时细胞中钙离子储存亦随之减少。本研究提示,参苓白术散加减方可调节UC小鼠体内促炎性因子含量,有利于减少UC小鼠血清及结肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α水平,并改善UC小鼠肠黏膜损伤。这与李姿慧等〔7〕、赵文晓等〔20〕报道结果相同。以上研究结果说明,参苓白术散加减方可通过调节炎症反应而改善UC小鼠病情,有利于促进结肠黏膜修复。

参苓白术散加减方可有效降低UC小鼠DAI评分并改善其结肠组织损伤程度,其作用机制可能是通过调控炎症反应实现的,可为参苓白术散加减方临床治疗UC提供实验支持。