EZH2抑制剂对恶性淋巴瘤细胞放疗抵抗、Th细胞分化及PD1/PD-L1表达的作用机制

王钧 王轶楠 肖建波 李海丽

(唐山市人民医院,河北 唐山 063001)

恶性淋巴瘤是一大类淋巴造血系统恶性肿瘤的总称,是临床常见的一类异质性极高的恶性肿瘤,据调查显示其发病与死亡率均呈整体上升趋势,这对患者的身体健康及生命安全造成了极大威胁〔1〕。目前,针对淋巴瘤的治疗方法主要包括化疗、放疗、免疫治疗等,然而临床治疗中常常出现耐药现象及有限的治疗效果,寻找新的治疗靶点至关重要〔2〕。恶性淋巴瘤病因复杂,目前尚未完全阐明,但研究表明其可能与免疫缺陷、病毒感染及遗传因素有关,其中免疫缺陷是目前临床研究的热点之一〔3〕。而Th细胞是一类关键的免疫细胞,有研究表明,不同亚群的数量及功能异常可导致机体细胞免疫功能紊乱,其中辅助性T淋巴细胞(Th)1/Th2细胞失衡是多种免疫疾病的发病基础,恶性淋巴瘤同样如此〔4〕。研究表明,程序性细胞死亡(PD)1与其配体PD-L1结合后可负向调控细胞的免疫应答,从而介导胞凋亡及肿瘤细胞的免疫逃逸,因此阻断PD1/PD-L1信号将成为治疗恶性淋巴瘤的新靶点〔5〕。目前随着对分子信号通路调控肿瘤细胞生物学行为的不断了解,针对特异性靶点而设计的分子靶向治疗药物在治疗恶性肿瘤方面已经取得了革命性的进展〔6〕。Zeste基因增强子同源物(EZH)2是一种组蛋白甲基转移酶,广泛存在于多种肿瘤细胞中,研究表明,EZH2存在高度表达与淋巴瘤进展、预后不良及耐药性发生之间的相关性,因此抑制EZH2活性成为治疗淋巴瘤的潜在策略〔7〕。本文探讨EZH2抑制剂对恶性淋巴瘤细胞放疗抵抗、Th细胞分化及PD1/PD-L1表达的作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器 电子显微镜(型号:DMI6000)、荧光倒置显微镜(型号:IX83)均购于上海辅泽有限公司;高能直线加速器(型号:Turebeam,美国Varian公司);低温冷冻离心机(型号:Medifriger-BL-S,北京金恒祥有限公司);Transwell小室(型号:3422,上海朗喜有限公司);多功能酶标仪(型号:Spark,北京赛百奥有限公司)。

1.2细胞、药物与试剂 MLMA恶性淋巴瘤细胞(货号:YS2749C,上海雅吉有限公司);多柔比星(货号:IR-12005,上海甄准有限公司);PD1/PD-L1抑制剂(货号:EY-22328,上海一研有限公司);EZH2抑制剂GSK343 (货号:B71421,上海睿铂赛有限公司);胎牛血清(货号:RY-F22,兰州荣晔有限责任公司);DMEM培养基(货号:A31600-500 ml,上海吉至有限公司);Hoechst33258染色液(货号:FS-79086,上海抚生有限公司);噻唑蓝(MTT)试剂(货号:M8180-1,北京索莱宝科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,货号:20688,上海嵘崴达实业有限公司);结晶紫〔货号:B5917-04,艾万拓化工产品贸易(上海)有限公司〕;酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号:HZ-E001,上海沪震有限公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(货号:9998029,江苏麦格有限公司);PD1抗体(货号:50124-R345-50)、PD-L1抗体(货号:10084-RP02-B)均购自北京义翘神州有限公司;GAPDH抗体(货号:AB0037,上海泊湾有限公司);电化学发光(ECL)检测试剂盒(货号:BES-3501,上海博尔森有限公司)。

1.3放疗抵抗细胞株的建立 取MLMA细胞,通过体外实验,在培养皿中将细胞株暴露在不同剂量的放射线(2、4、6、8 Gray)下,观察其存活率,选择适当的剂量,使细胞存活率50%～70%,进行体外放疗后,再次培养并扩增存活的细胞,重复该过程,每次增加放疗剂量,直到细胞能够在高剂量的放疗下存活,即放疗抵抗细胞株构建完成。

1.4细胞培养与分组 取放疗抵抗MLMA细胞,胰蛋白酶消化后接种于含10%的胎牛血清的DMEM培养基中,将其置于37 ℃、5% CO2培养箱中,恒温下传代培养,2～3 d换液传代1次,取对数生长的细胞制成细胞悬液后将其接种于48孔板中,将其分为恶性淋巴瘤(A)组、多柔比星(B)组、EZH2抑制剂(C)组、EZH2抑制剂联合PD1/PD-L1抑制剂(D)组,A组不加药,B组加入8 μg/ml的多柔比星,C组加入5 μmol/L的EZH2抑制剂GSK343,D组加入5 μmol/L的GSK343和5 μmol/L的PD1/PD-L1抑制剂Nivolumab,加药后将每孔液体体积补足,然后将孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养以备后续实验。

1.5Hoechst33258染色法检测细胞凋亡 取各组细胞,固定细胞10～15 min,三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(TBST)洗涤3次,将Hoechst33258染料溶液加入到固定且洗涤好的细胞中,孵育15～30 min,TBST缓冲液洗涤细胞3次,使用荧光显微镜观察细胞。

1.6MTT法检测细胞增殖 取各组细胞,将其接种于96孔板中,将MTT溶液添加到每个孔中,使其最终浓度为0.5 mg/ml,孵育2～4 h,将培养基中的MTT溶液去除,加入适量的DMSO,使甲基噻唑盐完全溶解,使用酶标仪,在570 nm波长下测量吸光度。

1.7Transwell法检测细胞侵袭 首先将24孔的Transwell装置放入1个含有适量的无血清培养基的培养皿中,并在小室内铺胶,然后取各组细胞制备成悬液,待基质胶凝后,向每个Transwell上室中添加相同数量的细胞悬液,使其均匀分布在上室底部,将Transwell装置放入1个恒温培养箱中,在37 ℃、5% CO2的条件下孵育24～48 h,孵育结束后,将Transwell装置取出,将上室液体倒掉,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次,结晶紫染色15 min,在倒置显微镜下观察细胞侵袭情况。

1.8ELISA检测Th细胞分化相关因子 取各组细胞,培养72 h后取细胞上清液,ELISA试剂盒检测Th1细胞因子干扰素(INF)-γ、Th2细胞因子白细胞介素(IL)-4含量。

1.9流式细胞仪检测Th细胞分化相关因子比率 取各组细胞,吸去培养基,PBS洗涤3次,0.25%的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液,在1 000 r/min的条件下常温离心5 min,弃掉上清液后,冰上封闭20 min,再次离心,弃掉上清液后PBS洗涤、重悬后,加入75%的乙醇冰上固定 20 min,将细胞浓度调整为1×106/ml,按照抗体说明书加入INF-γ及IL-4抗体,混匀后30 r/min摇床避光孵育30 min,PBS洗涤3次,再用500倍PBS重悬细胞,然后用流式细胞仪检测INF-γ及IL-4的表达比率。

1.10Western印迹检测 取各组细胞,在1 000 r/min的条件下离心5 min ,弃掉上清液,用预冷的PBS洗涤2次,加入1 ml RIPA裂解液,冰上裂解20 min并不时震荡,在4 ℃、12 000 r/min条件下离心20 min,取上清液,用二喹啉甲酸(BCA)法测定,首先进行蛋白定量,然后加入和上清液相同体积的蛋白上样缓冲液,煮沸3 min使其变性,然后用SDS-PAGE试剂盒进行电泳,电泳条件为300 V,电泳20 min,将凝胶上蛋白用半干法转移至甲醇活化的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,进行转膜、封闭后,按照说明书以适当比例稀释,然后加入稀释的PD1、PD-L1一抗,4 ℃孵育过夜后洗膜;加入辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1 h;洗膜后,用ECL荧光试剂盒测定结果,设置拍摄时间并进行连续曝光,选取最佳图像保存,用 ImageJ 分析软件分析各段条带的灰度值,以GAPDH为内参,计算与GAPDH比值求得PD1、PD-L1蛋白的相对表达含量。

1.11统计学分析 采用GraphPad Prism8.0软件进行t检验、χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组细胞凋亡 与A组相比,B、C、D细胞凋亡率明显升高,且C组比B组升高更明显,D组比C组升高更明显(均P<0.05),见表1、图1。

2.2各组细胞增殖 与A组相比,培养48 h时B、C、D组细胞增殖率明显降低,且C组比B组降低更明显,D组比C组降低更明显(均P<0.05),见表1。

2.3各组细胞侵袭 与A组相比,B、C、D组细胞侵袭数量明显降低,且C组比B组降低更明显,D组比C组降低更明显(均P<0.05),见表1、图2。

表1 各组细胞凋亡率、增殖率及侵袭数量、细胞中INF-γ、IL-4含量及PD1、PD-L1蛋白表达比较

图1 各组细胞凋亡(Hoechst33258染色,×200)

图2 各组细胞侵袭(结晶紫染色,×200)

2.4各组细胞Th分化果 与A组相比,B、C、D组细胞中INF-γ水平明显升高,IL-4水平明显降低,且C组比B组变化更明显,D组比C组变化更明显(均P<0.05),见表1、图3。

图3 各组细胞中INF-γ、IL-4流式细胞仪分析

2.5各组细胞PD1/PD-L1蛋白表达 与A组相比,B、C、D组细胞中PD1、PD-L1蛋白表达明显降低,且C组比B组降低更明显,D组比C组降低更明显(均P<0.05),见表1、图4。

图4 各组细胞PD1、PD-L1蛋白表达

3 讨 论

恶性淋巴瘤是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤,通常发生在淋巴结、脾脏、骨髓和其他淋巴组织中,我国该病的发病率男性多于女性,且呈低龄化趋势,其死亡率也可占恶性肿瘤的第十位,可见早期认识、诊断和治疗非常重要,可以提高患者的生存率和生活质量〔8,9〕。

本文结果说明,EZH2抑制剂可有效降低恶性淋巴瘤细胞放疗抵抗。放疗是临床治疗肿瘤的有效手段,其使大多数患者得以生存,但尽管如此,仍有部分患者对一线放疗方案治疗无效,故复发、放疗抵抗仍旧是淋巴瘤临床治疗上的一个巨大挑战〔10〕。放疗主要是通过利用高能射线杀死或抑制肿瘤细胞的生长和分裂来达到治疗目的,而放疗抵抗是指肿瘤细胞对放疗具有抵抗性,从而导致放射线杀伤肿瘤细胞作用不明显,故细胞的凋亡、增殖及侵袭可作为显示放疗抵抗的有效指标〔11〕。多柔比星是临床治疗恶性淋巴瘤的常用药物,其疗效确切,但具有心脏毒性,同时还可能导致患者出现胃肠道反应,且近年来由于广泛使用使得其耐药性显著增加,因此探寻一种新型的治疗手段显得尤为重要。研究发现,表观遗传学修饰导致的表型及功能改变在肿瘤的发生进展中发挥着重要作用,而EZH2作为核心组分,有研究证实,其在多种肿瘤中异常表达,在淋巴瘤中是呈高表达,因此EZH2抑制剂治疗应运而生〔12〕。对于恶性淋巴瘤细胞,EZH2抑制剂可能是通过抑制相关甲基转移酶活性,来抑制EZH2基因的转录及表达,从而抑制下游相关信号通路及因子的表达,进而达到抑制细胞增殖及侵袭、促进细胞凋亡的目的,最终有效恢复癌细胞自稳态,降低细胞应激反应,降低放疗抵抗。蔡露青〔13〕研究表明,抑制EZH2的表达可显著增强自然杀伤(NK)-T淋巴瘤细胞的凋亡,降低其放疗抵抗,这说明其有可能成为今后治疗NK/T淋巴瘤的一个新型治疗靶点,这与本文结果类似。

本文结果说明,EZH2抑制剂可显著促进Th细胞向Th1分化,抑制其向Th2分化。Th1和Th2细胞是人体免疫系统中的两种T细胞亚群,其在调节免疫反应中起着重要的作用,然而,当涉及癌症时,Th1和Th2细胞的平衡可能被扰乱〔14〕。Th1细胞主要参与细胞介导免疫应答,产生INF-γ和其他细胞因子,能够激活巨噬细胞和细胞毒性T细胞,对抗肿瘤细胞,Th1细胞的免疫应答有助于控制和消除肿瘤细胞;Th2细胞主要参与体液免疫应答,产生IL-4等细胞因子,并促使B细胞分化为浆细胞,产生抗体,故高水平的Th2细胞反应可能与肿瘤发展有关,因为其可能促进炎症反应和肿瘤微环境的形成,从而支持肿瘤生长和转移〔15,16〕。因此,调节Th1/Th2细胞免疫平衡可能是癌症治疗的一个重要策略。对于恶性淋巴瘤细胞,EZH2抑制剂可能是通过调控相关特异性转录因子,来促进INF-γ、抑制IL-4分泌,从而纠正Thl/Th2细胞免疫失衡,进而到达抑制免疫反应、抑制致癌基因激活及抑癌基因突变等目的,最终有效杀伤癌细胞。陈朝伦等〔17〕研究发现,与健康对照组相比,淋巴瘤组中INF-γ明显升高,IL-4明显降低,这说明监测其水平有助于淋巴瘤的诊断与预后判断,这与本文结果类似。

本文结果说明,EZH2抑制剂可显著PD1/PD-L1的转录及合成。PD1和PD-L1 蛋白属于一对共抑制分子,是一种Ⅰ型跨膜蛋白,有研究表明,其相互结合可对T细胞的免疫应答有负性调控作用,同时其与细胞凋亡有关,可作为细胞死亡的标记蛋白〔18〕。目前已有研究证实,PD1/PD-L1在包括淋巴瘤在内多种肿瘤中表达上调,从而参与机体免疫反应及细胞凋亡等进程,并介导肿瘤细胞免受监视,因此PD1和PD-L1作为肿瘤免疫治疗的靶点已经成为临床研究的热点及焦点〔19〕。而对于恶性淋巴瘤细胞,EZH2抑制剂可能是通过抑制相关蛋白激酶活化及上游相关信号通路的转导,来调控机体免疫应答,从而抑制PD1/PD-L1表达、抑制其相互结合,进而促进T细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤、抑制细胞周期相关蛋白活化等,最终有效抑制肿瘤细胞免疫逃逸及生长,促进细胞凋亡。王平等〔20〕研究发现, PD1/PD-L1蛋白表达在淋巴瘤中均上调表达,说明其在肿瘤的发病或进展中可能具有重要作用,这与本文结果类似。

综上,EZH2抑制剂可显著抑制恶性淋巴瘤细胞放疗抵抗,有效调控Th细胞分化,并抑制PD1/PD-L1蛋白表达。