芪黄疽愈方对ASO大鼠血液流变学和血脂指标及miR-133a、TNF-α表达的影响

孙云朝 郭娜 葛建立 马云龙 张欣 苏坤 白建英

(河北省中医院 1周围血管科,河北 石家庄 050011;2肿瘤二科;3河北中医学院护理学院)

肢体动脉硬化闭塞症(ASO)是外科临床常见病〔1〕。现代研究表明,ASO是由于动脉粥样硬化导致下肢供血动脉内膜增厚、管腔狭窄或闭塞,从而使肢体出现一系列缺血症状的慢性进展性疾病〔2〕。ASO的发病机制尚不明确,但多数学者认为内膜损伤对ASO的形成作用更为突出〔3〕。ASO药物治疗尚缺乏理想药物,外科手术治疗存在创伤大、移植物长期通畅率低等问题,介入治疗的疗效还存疑〔4〕。因此,如何预防和治疗ASO仍然是医学界的难题。炎症反应在宿主防御、清除和减缓微生物入侵时的感染方面起着至关重要的作用,在炎症反应过程中,细胞产生多种细胞因子,触发或增强特异性炎症反应〔5〕。肿瘤坏死因子(TNF)-α在许多免疫和炎症过程中起着至关重要的作用,如增殖、凋亡、坏死和细胞存活等,其在协调细胞因子级联和炎症细胞因子产生的主要调节器中起作用。TNF-α信号异常可导致许多疾病,包括类风湿关节炎、银屑病、克罗恩病、动脉粥样硬化和癌症。由于TNF-α的重要性,调节TNF-α活性是治疗相关疾病的关键〔6〕。miRNA是一类内生的不具备编码功能的小分子RNA,其能对mRNA的翻译起到阻碍作用,或是促使靶mRNA被降解,参与细胞的生长、凋亡、迁移等〔7〕。有研究证明miR-133a在ASO平滑肌细胞中有明显表达,其能促进人动脉平滑肌细胞的增殖和迁移〔8〕。但有关miR-133a与ASO关系的研究较少,其具体作用机制仍需要研究和验证。中医学认为ASO属“脱疽”范畴,认为其发病病机气虚推动无力,素体气阴两虚,痰瘀互结为癥,日久最终导致痰瘀阻络形成“脱疽”,治疗需以益气养阴、消癥散结、通经活络为主〔9〕。芪黄疽愈方是本课题组多年临床经验组成的验方,而有关芪黄疽愈方在ASO中的研究和应用已有报道〔10,11〕。本实验通过高脂饮食喂饲联合隐动脉内膜损伤方法制作大鼠ASO模型,探讨芪黄疽愈方对ASO模型大鼠炎症相关因子与miR-133a表达的影响,为芪黄疽愈方通过抑制炎症反应、保护动脉内皮、防治ASO提供实验数据。

1 材料与方法

1.1动物 选择雄性SD 大鼠96只,4～6周龄,由河北医科大学实验动物中心提供(合格证号:20194PP22),体质量(200±20)g。

1.2药物 芪黄疽愈方:黄芪20 g、鸡血藤15 g、海藻、黄精、延胡索、鬼箭羽、红花各12 g、土鳖虫、牛膝各9 g,按照原方组方比例,并根据体表面积比率折算出200 g大鼠等效用药剂量作为中浓度组,另取1/2剂量和2倍剂量作为低浓度组和高浓度组,饮片全部取自河北省中医院药剂科,并经过2位以上药剂师鉴定符合各项规定,水煎后,4 ℃冰箱保存,芪黄疽愈方组最终浓度为0.5、1.0、2.0 g生药/ml。

1.3试剂及仪器 高脂饲料组方:83.15%基础饲料、5%猪油(河北医科大学实验动物中心)、10%蛋黄粉(北京金健力科技公司)、1%胆固醇和0.15%胆酸钠(淮北中迈生物科技有限公司)等。西洛他唑片(浙江大冢制药有限公司,批号:H10960014)。

1.4ASO模型建立 雄性SD大鼠96只饲养1 w,随机选择18只作为空白组;剩余78只采用高脂饮食喂饲联合隐动脉内膜损伤的方法建立大鼠ASO模型,造模成功后随机分为模型组18只,西药组、芪黄疽愈方高、中、低浓度组各15只。采用高脂饮食喂饲联合隐动脉内膜损伤方法制作大鼠ASO模型〔10〕,实验前适应性喂养1 w,然后高脂饲料喂养1 w。采用1%戊苯巴比妥钠(1 ml/200 g)腹腔注射麻醉大鼠,从腹股沟中点向后肢内侧纵行切开皮肤,暴露隐动脉,动脉夹阻断隐动脉,将0.2～0.3 ml注射用无菌蒸馏水缓慢注入阻断部位血管,至血管充盈为止,压迫止血,缝合切口,内膜损伤模型完成。

1.5给药方法 空白组:自由饮水,普通饮食喂养。模型组:建立ASO模型,造模1 w后,给予生理盐水(1 ml/100 g大鼠)灌胃,自由饮水,1次/d,连续12 w。芪黄疽愈方组(中药低、中、高浓度组):建立ASO模型,造模1 w后,芪黄疽愈方相应浓度中药灌胃(0.1、0.5、1.0 ml/100 g体质量),自由饮水,1次/d,连续12 w。西药组造模1 w后,给予西洛他唑片灌胃治疗,药量18 mg/kg,1次/d,连续12 w。

1.6各组一般状态 包括毛色、体质量、活动灵敏度、饮食、饮水量等。治疗12 w末次给药前禁食12 h,给药1 h后,麻醉同前,切取大鼠左后肢隐动脉,用4%多聚甲醛溶液固定并进行常规石蜡包埋。分别于治疗前、治疗12 w后,经下腔静脉采血约8 ml,2 500 r/min 离心5 min后,分离出血清分为2份,于-80 ℃保存,用于免疫学检测。

1.7血浆血脂检测 用全自动生化分析系统检测血浆总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.8全血检测血流变学指标 由腹主动脉采血4～5 ml至抗凝采血管中,混匀后于血流变分析仪上进行全血测试,包括高切指数、低切指数与红细胞聚集指数等。

1.9酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中TNF-α含量 取全大鼠血样本,提取外周血血清,采用ELISA法检测血清中TNF-α蛋白表达。操作步骤按ELISA试剂盒说明书进行操作,测量样本490 nm处光密度(OD)值。

1.10基因芯片检测miRNA表达 选取模型组及空白组各3只,将两组动脉组织样本送至上海吉凯基因公司,按照安捷伦miRNA表达谱芯片(大鼠)标准化操作流程进行芯片分析。靶基因预测通过TargetScan、miRWalk和miRDB进行miRNA155-5p 在线数据库预测miRNA的潜在靶基因,并取两者的交集作为最终候选靶基因。

1.11Western印迹分析 大鼠动脉组织用组织蛋白提取试剂盒提取全蛋白后,用细胞裂解试剂(MO)裂解细胞,提取总蛋白。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量蛋白(约30 μg)后将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后一抗(用5%脱脂奶粉1∶500稀释)4 ℃孵育过夜后磷酸盐缓冲液(PBS)进行3次洗涤,5 min/次,洗膜后再用二抗室温下孵育2 h,加入显色剂曝光后,使用融合SL成像系统(Viber Lourmat,法国)显色,以GAPDH为内对照。将胶片进行拍照,用凝胶图像处理系统分析目标带的OD值。

1.12RT-q聚合酶链反应(PCR)检测血清和组织中miR-133a和TNF-α mRNA含量 取同时间组织和全血样本,提取总RNA,逆转录合成 cDNA。然后进行实时PCR扩增。引物序列:miR-133a正向引物5′-CAAGCTGGTAAAAATGGAA-3′,反向5′-TATGGTTTTGACGACTGTGTAT-3′;TNF-α正向引物5′-ATCCAGTGAGTTCCGAAAGC-3′,反向5′-ATCCAGTGAGTTCCGAAAGC-3′。应用U6作为内参,正向引物5′-TGCGGGTGCTCOGCTTOGGC-3′,反向5′-CA-GTGCAGGGTCCGAGGTCT-3′。具体反应条件为:95 ℃进行5 min预变性,95 ℃ 30 s 变性,60 ℃ 1 min退火,72 ℃进行30 s延伸,共进行45个循环,再72 ℃ 10 min延伸。应用2-△△Ct法计算miR-133a表达量。

1.13病理检查 脱颈椎处死大鼠,立即打开腹腔,取右下肢股动脉,石蜡包埋、切片、苏木素-伊红(HE)染色观察。

1.14统计学方法 采用SPSS19.00软件进行方差分析、t检验及Pearson相关分析。

2 结 果

2.1各组一般情况比较 空白组毛色光泽,体质量随饲养时间延长而增,活动灵敏,饮食、饮水量正常,无死亡。与中药组比较,模型组精神萎靡,活动欠灵敏,毛色暗淡,开始体质量增长迅速,然后增长速度减缓,食量相对空白组也减少。中药组随着用药剂量的增加,大鼠恢复正常越显著,无死亡。

2.2各组TC、TG、LDL-C、HDL-C表达比较 与空白组比较,模型组治疗后血清TC、TG、LDL-C值显著升高,HDL-C值显著降低(P<0.05);与本组治疗前比较,治疗后空白组与模型组TC、TG、LDL-C、HDL-C值无统计学差异(P>0.05),西药组、中药各浓度组TC、TG显著降低,西药、中药高浓度组LDL-C值显著降低(P<0.05);与模型组治疗后比较,西药组、中药各浓度组血清TC、TG值显著降低,西药、中药高浓度组LDL-C值显著降低(P<0.05);TC值由中药低浓度组到高浓度组依次降低,差异有统计学意义(P<0.05),中药高浓度组(LDL-C值)显著低于中、低浓度组(P<0.05),见表1。

表1 各组TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.3各组用药前后血流变学指标比较 与空白组比较,治疗后模型组红细胞聚集指数、低切指数、高切指数明显升高(P<0.05,P<0.01);与本组治疗前比较,西药组、中药各浓度组以上指标显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组治疗后比较,西药组、中药各浓度组以上指标显著降低(P<0.05,P<0.01);治疗后红细胞聚集指数、低切指数、高切指数由中药低浓度组到高浓度组依次降低,两两比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.4基因芯片检测miRNA表达 取模型组和空白组血进行差异基因分析,结果如图1、2所示。以P<0.05,差异倍数(FC)>1.5为筛选标准,选取了表达差异较大的miR-133a。

2.5靶基因预测 通过TargetScan、miRWalk和miRDB进行miR155-5p靶基因预测,韦恩图取交集后,选取TNF-α为目标靶基因,并预测miR-133a和TNF-α的作用靶点,见图3、图4。

2.6各组用药前后miR-133a、TNF-α表达比较 与空白组比较,治疗后模型组TNF-α含量、miR-133a、TNF-α mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01);与本组治疗前比较,西药组、中药各浓度组以上指标明显降低(P<0.05,P<0.01);与模型组治疗后比较,西药组、中药各浓度组以上指标明显降低(P<0.05);治疗后,以上指标由中药低浓度组到高浓度组依次降低,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见表2、表3、图5。

表2 各组用药前后血流变学指标及TNF-α蛋白表达比较

N为空白组,T为模型组图1 基因芯片检测空白组及模型组中差异miRNA表达

2.7RT-qPCR检测各组组织中miR-133a、TNF-α mRNA表达 与空白组比较,治疗后模型组miR-133a、TNF-α mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与本组治疗前比较,西药组、中药各浓度组以上指标显著降低(均P<0.01);与模型组治疗后比较,西药组、中药各浓度组miR-133a、TNF-α mRNA表达水平明显降低(均P<0.05);治疗后miR-133a、TNF-α相对表达水平由低浓度组到高浓度组依次降低,两两比较差异有统计学意义(均P<0.01,P<0.05)。

见表3。这与大鼠血中检测miR-133a、TNF-α mRNA表达结果具有一致性。

红色:miRNA高表达,绿色:miRNA低表达图2 miRNA差异表达

图3 韦恩图

图4 miR-133a和TNF-α的靶基因预测及作用靶点

表3 各组用药前后血清miR-133a、TNF-α含量及mRNA表达水平比较

图5 Western印迹检测各组治疗前后TNF-α蛋白表达

2.8各组病理结果 空白组内皮细胞层完整,平滑肌层以平滑肌细胞和弹力纤维为主,内掸力板连续规整,无增殖及脂质沉积。模型组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,空泡细胞、脂质沉积。中药各浓度组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,空泡细胞、脂质沉积随着中药浓度增加而减少。西药组纤维母细胞大量代替内皮细胞,内膜增厚、部分管腔闭塞,有少量空泡细胞,脂质沉积较少,见图6。

图6 各组动脉内皮病理变化(HE染色,×100)

2.9miR-133a与各指标相关性 miR-133a与TNF-α(r=0.814,P=0.001)、血脂指标〔TC、TG、LDL-C(r=0.633、0.732、0.573,P=0.016、0.002、0.025)〕、血流变学指标〔红细胞聚集指数、低、高切指数及动脉脂肪沉积量呈正相关(r=0.749、0.764、0.832、0.583,P=0.011、0.003、0.001、0.020)〕。

3 讨 论

ASO作为动脉粥样硬化累及周围动脉的一种临床表现,病残率和病死率较高,当前在我国的患者数不断增多,严重危害身体健康和生活质量〔12〕。现代研究表明,多种炎症细胞因子参与了粥样硬化斑块的形成、破裂及血栓形成,内皮细胞的损伤、血管活性因子的失调,导致内膜下基质暴露于血流中,促使多种血管活性物质释放,内源性及外源性凝血系统被激活,诱导血栓的形成,从而导致ASO的发生〔13〕。利用大鼠制作ASO模型,通常方法为高脂饮食喂饲联合隐动脉内膜损伤,其能在较短时间内建立较成熟的动脉粥样硬化斑块模型〔14〕。

中医历代医家从病因病机到诊断治疗均有记载,虽疗效尚可,但多不稳定,每易复发,且大多仅为临床经验的总结,尚缺乏系统的科学论证。根据“气血津液”“标本虚实”及“久病入络”等理论,ASO属中医学“脱疽”等范畴〔15〕。脱疽是气阴两虚为本,病位在血脉,为本虚标实之证,经络癥积瘀结为标,在治疗上需要益气养阴、消癥散结、通经活络〔16〕。在芪黄疽愈方中,黄芪益气固表;黄精补气养阴,益肾填精;红花活血化瘀;鬼箭羽、延胡索、鸡血藤通经活血,行气止痛;土鳖虫、海藻破瘀通经,化痰散结;牛膝破血通经,引药下行。诸药合用可行血通络。现代医学认为黄芪皂苷可延长电刺激大鼠颈总动脉形成血栓的时间,有较好的抗内皮细胞损伤的作用〔17〕。黄精具有调节高脂血症血脂代谢和抗动物粥样硬化形成的作用,也具有增强免疫功能及抗脂质过氧化的作用〔18〕。红花也抑制血小板聚集和抑制凝血系统,也可以通过降血脂和抗氧化来干预动脉粥样硬化〔19〕。鬼箭羽、土鳖虫等都具有延缓动脉粥样硬化形成的作用。延胡索、鸡血藤、牛膝都具有扩血管、抗血小板聚集的作用。血脂代谢紊乱与动脉粥样硬化形成有相关性,血脂可刺激纤维组织增生,形成动脉粥样斑块〔20〕。在血液流变学指标中,血液黏度升高,增加了血液对血管壁的浸润机会,使血管壁的内皮增厚〔21〕。也有研究表明,血液流变学异常先于动脉硬化的形成,其改变对微循环障碍、促进血管损伤等具有重要作用〔22〕。临床研究也表明芪黄疽愈方能明显改善ASO患者的患肢血液循环,降低致残率〔23〕。本研究提示,芪黄疽愈方能明显改善ASO症状和血脂指标,这与以往研究结果具有一致性。同时本研究还发现,芪黄疽愈方可能通过改变血液流变学异,改变微循环障碍,促进血管内皮的修复;病理学分析发现,芪黄疽愈方能够明显降低脂质沉积,随中药浓度增加而减少,这与本研究其他结果一致。

ASO主要发生于下肢中小动脉,其病因尚不明确〔24〕。目前认为多种炎症细胞因子在粥样硬化斑块的形成、破裂及血栓形成中起促进作用〔25〕。现代研究认为,TNF-α等因子在炎症反应过程中较为关键,因此调节机体炎症细胞因子,抑制炎症反应,能保护血管内皮,达到防治ASO的目的〔26〕。本研究提示,TNF-α可能参与了ASO发生的炎症反应。通过芪黄疽愈方治疗后,本研究还发现TNF-α表达显著降低,这与以往研究发现芪黄疽愈方具有抗病毒、抗炎症细胞因子、免疫调节、补血活血、抗肿瘤等多种作用一致,其也与扩张冠状动脉,抑制血小板聚集,抗心律失常,增加冠脉血流量,改善心肌供氧等药理作用〔27〕的结果具有一致性。其机制可能是通过TNF、集落刺激因子等影响,增加其免疫活性,可使血管再生因子的数量增加。不过由于时间、经费等原因,本研究未能阐明芪黄疽愈方单味中药对炎症细胞因子的作用机制,将在后续的研究中进行深入分析。

miRNA为一类内生性非编码小分子RNA,可作用于多个靶基因,从而参与细胞的增殖、凋亡等,调控多种疾病的发生发展。miR-133a由位于7号染色体的基因编码和转录,在机体发生炎症过量释放时表达上调,可具有一定的组织特异性〔28〕。研究表明,miR-133a主要位于ASO的平滑肌细胞中〔29〕,其通过靶向肾素-血管紧张素系统同源基因家族成员(Rho)A调节动脉平滑肌细胞增殖和迁移,miR-133a可能参与了ASO的发病机制〔30〕。本研究结果提示,miR-133a可对上述指标产生影响,在ASO病程中发挥作用。推测芪黄疽愈方可能通过抑制miR-133a表达降低炎症因子TNF-α表达水平,从改变血脂指标、血流变学指标及动脉脂肪沉积量,这与本研究靶基因预测结果具有一致性。