尿液中环状RNA-0071196表达与膀胱尿路上皮癌患者临床病理特征的关系

杨杨 姚伟祥 叶旭莹 邹戈

(广州市番禺区中心医院,广东 广州 510000)

膀胱癌已成为全球范围内最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。根据统计数据,约90%的膀胱癌病例经组织学检查被定义为膀胱尿路上皮癌。2020年,膀胱癌的发病率在所有恶性肿瘤中位居第10位,而在男性泌尿系统恶性肿瘤中,其发病率和死亡率均排名第2〔1,2〕。据统计,全球膀胱癌的患者数量已经超过40万,且男性患者比例比女性更大,好发于60岁以上的人群,40岁及以下年龄段的个体更容易受到膀胱癌的影响,这主要归因于他们更容易接触到一些有毒物质,例如尼古丁,这也是膀胱癌的主要诱因之一〔3,4〕。当前诊断膀胱癌的金标准仍然是通过膀胱镜检查进行组织活检。核基质蛋白22和膀胱肿瘤抗原的胶体金免疫层析法作为无创的检查方法,是美国食品和药物管理局批准的临床方法,然而,它们的灵敏度太低,且血尿容易导致假阳性结果〔5～7〕。因此,迫切需要一种平衡灵敏度和特异性的膀胱癌诊断方法。环状RNA(circRNA)是一类闭合的RNA分子,通过3′和5′两端相连而形成的闭合环形分子,具有多样的序列构成,可以由外显子或内含子形成。越来越多的研究表明它们在许多生物学过程中起着重要作用〔8〕。尽管circRNA的具体作用尚未被完全揭示,但目前研究表明,circRNA充当微小RNA(miRNA)的“分子海绵”,与miRNA通过竞争性结合相互作用,并且可以间接影响信使RNA(mRNA)下游目标基因的表达,构建出一个复杂的调控机制〔9〕。研究表明〔10〕,尿液中circRNA在多种疾病中的表达水平会发生变化,这为circRNA作为一种新型诊断和治疗方法提供了潜在机会。与其他采样方法不同,尿液采集是一种非侵入性、非创伤性、无痛苦的采样方法,非常方便和实用,可以提高疾病的早期诊断及治疗的准确性和有效性〔11〕。但circRNA在膀胱癌患者尿液中的临床诊断价值仍需探究。因此,本研究通过前期研究发现circRNA-0071196在膀胱癌组织中过表达,并研究circRNA-0071196在膀胱癌患者尿液中的表达及进行临床病理特征分析,旨在探究尿液中circRNA作为膀胱癌生物标志物的潜力。

1 材料与方法

1.1实验分组与标本处理 共采集40例膀胱尿路上皮癌尿液样本(膀胱癌组)和30例正常样本(对照组),均来自广州市番禺中心医院。膀胱癌组男27例,女13例;平均年龄(63.15±15.18)岁;对照组男16例,女14例,平均年龄(62.4±9.38)岁。两组性别构成及年龄无显著差异(P>0.05)。样本均经过组织病理学验证。在使用前,尿液样本被存储在-80 ℃的冰箱中。本研究已获得广州市番禺中心医院伦理委员会的批准。

1.2总RNA抽提及qRT-聚合酶链反应(PCR) 通过Trizol法从尿液样本中提取RNA,提取后的RNA使用 Nanodrop2000 微量紫外分光光度计检测其浓度及纯度,使用RNase R消化总RNA以去除线性RNA并富集circRNA浓度和纯度后进行下一步反转录。反转录使用Super-ScriptTMⅢ Reverse Transcriptase试剂盒,按说明书要求进行操作。实时定量PCR 使用Step One Plus PCR仪,反应体系为20 μl,反应条件:以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因,circRNA-0071196相对表达量采用2-ΔΔCt进行计算。circRNA-0071196 引物序列为:上游:5′-TGCTTATAGAAGGAACAAGCAG-3′,下游:5′-TACTCATATTTGAAACCGGATCT-3′;GAPDH引物序列为:上游:5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游:5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0软件进行学生t检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线和ROC曲线下面积(AUC)对circRNA-0071196的诊断特异性和灵敏性进行评价。

2 结 果

2.1两组尿液中circRNA-0071196表达水平差异 与对照组(1.75±1.01)比较,膀胱癌组尿液中circRNA-0071196表达水平(5.10±1.88)显著上调(t=8.840,P<0.05)。

2.2膀胱癌患者的基本临床特征与尿液标本中circRNA-0071196表达水平的关系 circRNA-0071196相对表达水平在性别组成、年龄、是否淋巴结转移无统计学差异(P>0.05)。circRNA-0071196相对表达量与膀胱癌T分期、肌层浸润及病理分级具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 膀胱癌患者的基本临床病理特征与尿液标本中circRNA-0071196相对表达量比较

2.3circRNA-0071196水平检测膀胱癌患者的敏感性和特异性 通过ROC曲线结果显示:circRNA-0071196水平检测能有效区分膀胱癌组和对照组〔AUC=0.935(95%CI:0.876～0.994)〕。见图1。

图1 尿液中circRNA-0071196对预估诊断膀胱癌的ROC曲线

3 讨 论

近年来,我国膀胱癌的发病率和死亡率都呈现出明显的上升趋势。即使患者采取手术、化疗、放疗等治疗措施,膀胱癌的复发率仍然较高,同时也致使患者的5年生存率处于较低水平〔12,13〕。针对膀胱癌患者治疗和预后面临的挑战,在积极探索新的治疗手段和方法的同时,寻找和识别新的膀胱癌生物标志物具有重大意义。通过分析生物标志物,医师能够精细检测、识别、分析患者的健康情况,为他们制定有效的治疗策略,从而大大提高临床治愈率,有利于患者的预后。目前,膀胱癌诊断主要依赖于影像学检查方法(比如泌尿系统的彩色多普勒超声检查和增强CT扫描)、尿细胞学检查、膀胱镜检及实验室特异性标志物筛查〔14～17〕。然而,这些检查手段在灵敏度、特异性和患者接受程度方面存在较大的不同。因此,迫切需要开发一种新型的检查方法,能够快速、便捷且更精确的提升对膀胱癌的诊断能力。

本文前期实验中通过使用基因芯片技术检测了4例膀胱癌和匹配的癌旁组织中circRNAs的表达谱,最终发现127个在膀胱癌及其癌旁组织中差异表达的circRNA,其中上调circRNA 89个,下调circRNA 38个。结果显示,circRNA-0071196可能参与膀胱癌的发生发展〔18〕,有证据表明,circRNA的作用机制是充当“miRNA 海绵”。在这个过程中,circRNA 可能会和 miRNA 进行竞争,从而抑制 miRNA 的转录,阻碍 mRNA 的转录。一些研究已经确定了多种能够充当 miRNA 海绵的 circRNA,并展示了它们作为基因表达重要调节因子的潜力〔19〕。尿液circRNA是一个新的研究领域,由于尿液中的circRNA可以稳定存在,并反映机体内的病理生理变化,越来越多的研究结果显示,它可能作为多种疾病生物标记物〔20,21〕。目前已有用于膀胱癌诊断的一些实验室生物标志物,例如核基质蛋白(NMP)22、膀胱肿瘤抗原(BTA)和纤维蛋白降解产物(FDP),虽已投入使用,但这些标记物的敏感性和特异性仍有待提高。据报告,NMP22的敏感性为73%,特异性为80%;而BTA的敏感性为50%,特异性为86%;FDP的敏感性为61%,特异性为79%〔22,23〕,因此,寻找一种新的液体实验室标志物具有重要意义。由于尿液样本的非侵入性和易于采集的特点,预示尿液circRNA作为肿瘤标志物具有广阔应用价值。尿液circRNA已经被发现在结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌等多种癌症类型中有显著变化,因此它们可能用于癌症早期诊断及预测肿瘤的临床进展情况。尽管目前的研究还需要进一步验证,但尿液circRNA可能成为未来癌症筛查、诊断和治疗领域中一个重要的研究方向〔24～28〕。

本实验结果表明,尿液中circRNA-0071196的表达与膀胱癌细胞的分化程度和浸润性生长可能存在密切联系;ROC曲线结果表明,circRNA-0071196表达水平在膀胱癌的诊断中具有一定价值。未来可以将尿液中circRNA-0071196水平检测纳入膀胱癌诊断的实验室指标,以更好地评估患者的病情和监测治疗效果,对于探寻新的膀胱癌候选肿瘤标志物及治疗靶点具有重要意义。