miR-145在甲状腺乳头状癌组织中表达及其对淋巴结转移和预后的预测价值

吴翠翠 张雪琦 吴志坚

(北华大学附属医院检验科,吉林 吉林 132011)

甲状腺乳头状癌(PTC)的发病率呈逐年增加趋势,尤其是发生淋巴结转移后其生存期更短,这主要因为发生淋巴结转移后肿瘤更易侵犯甲状腺外血管和器官及与自身因素密切相关〔1〕。微小RNA(miR)在多种肿瘤中均有异常表达,在调节肿瘤发生和肿瘤发展方面起重要作用,包括生长、转移和凋亡。既往研究表明,miR-145在大多数肿瘤组织中均呈低表达,发挥抑癌基因的作用。兰天等〔2〕通过体内、体外实验研究证实,miR-145-5p在甲状腺癌细胞中低表达,miR-145-5p过表达可显著降低甲状腺癌细胞的迁移和侵袭能力,并降低裸鼠体内移植瘤的体积和重量,表明miR-145的异常表达有望作为PTC进展的生物标志物,但目前尚缺乏miR-145在人PCT组织中表达的报道。本文拟分析miR-145在PTC组织中的表达情况及其与淋巴结转移和预后的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年1月至2021年12月在北华大学附属医院甲状腺外科进行手术后经病理确诊为PTC患者64例,平均年龄(59.4±5.6)岁,伴颈部淋巴结转移者23例。

1.2组织标本的采集与处理 患者行全身麻醉或局部麻醉后,依据肿瘤发生部位、病变范围、类型及淋巴结转移情况行针对性手术治疗。手术切除组织离体后,取部分癌组织和距癌组织边缘3 cm处癌旁组织,用焦碳酸二乙酯(DEPC)-磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后迅速置于液氮中保存备用。查询病例信息管理系统,详细了解并记录患者年龄、性别、肿瘤直径及淋巴结转移等基本信息。

1.3主要仪器与试剂 Applied Biosystems 7500 Fast逆转录-荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)仪购自美国ABI公司,RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司,RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒购自美国Life Technologies公司,FS Universal SYBR Green Master实时荧光定量PCR试剂购自瑞士罗氏公司。根据NCBI GeneBank数据库及Primer6.0设计引物,miR-145-5p-RT引物:5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-CGGCAATTCAGTTGAG-AGGGAT-3′,miR-145-5p正向引物:5′-ACACTCC-AGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGA-3′,反向:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′,引物由苏州吉玛基因公司合成。

1.4RT-qPCR法检测甲状腺癌组织及癌旁组织中miR-145水平 将收集的组织从液氮中取出,剪碎后取适量体积的组织置于研磨器中研磨成粉末,加入1 ml Trizol充分混合,裂解15 min。依次加入氯仿、异丙醇、80%乙醇洗脱纯化析出,超微量分光光度计检测RNA浓度及纯度,脂凝胶电泳成像检测RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis试剂盒反转录为cDNA保存于-20 ℃冰箱中。取2 μl cDNA作为模板配制25 ml RT-qPCR体系,按照FS Universal SYBR Green Master说明书,以U6为内参,在Applied Biosystems 7500 Fast实时荧光定量PCR仪上进行PCR。反应条件:预变性95 ℃ 5 min,扩增步骤95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,扩增结束后绘制溶解曲线,根据2-ΔΔCt方法计算各组miR-145-5p表达水平差异。

1.5统计学方法 采用SPSS25.0软件进行t检验、χ2检验、非参数检验、Kaplanmeier法及Logrank检验。通过非条件单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析影响PTC患者预后的相关因素。

2 结 果

2.1PTC及其癌旁组织中miR-145相对表达量比较 PTC组织中miR-145的相对表达量(0.437±0.099)显著低于癌旁组织(1.076±0.216;t=-21.333,P<0.001)。

2.2PTC患者甲状腺癌组织miR-145表达与临床病理特征的关系 甲状腺癌组织中miR-145表达水平与患者年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤部位及病灶情况无显著相关性(P>0.05),与病理分级、UICC分期及淋巴结转移具有显著相关性(P<0.05,P<0.01),见表1。

表1 甲状腺癌组织中miR-145的表达与患者临床病理特征的关系及影响PTC患者预后的影响因素〔n(%)〕

2.3PTC患者预后生存情况 PTC患者自出院后随访8～62个月,中位时间686 d,生存分析结果表明,miR-145高表达(≥0.448)和低表达(<0.448)患者5年总生存率分别为93.75%(30/32)和81.25%(24/32),差异有统计学意义(χ2=4.267,P=0.039)。Kaplan-meier生存分析结果显示,低表达miR-145患者与高表达患者相比预后较差,具有显著差异(P<0.05),见图1。

图1 不同miR-145表达PTC患者生存分析

2.4影响PTC患者预后的危险因素 经单因素分析得出,肿瘤直径越大、病理分级越高、分期越晚、有淋巴结转移及miR-145低表达时,患者5年生存率越低(P<0.05,P<0.01),见表1。

2.5影响PTC患者预后的独立危险因素 经多因素Cox 比例风险回归模型分析得出,Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移及miR-145低表达均为PTC患者预后的独立危险因素(P<0.05,P<0.01),见表2。

表2 影响PTC患者预后的COX多因素分析

3 讨 论

miRNA是一类短小的非编码RNA分子,可以通过调节基因表达来参与细胞的生物学过程。研究表明,miRNA在PTC的发生和发展中起到重要调控作用〔3～6〕。miR-146b、miR-221和miR-222等miRNA的表达水平在PTC中显著上调,而miR-181b和miR-21等miRNA的表达水平则下调,这些miRNA的异常表达可能与PTC的发生、转移和预后密切相关〔7〕。研究发现,miR-146b的上调与PTC的增殖和侵袭能力增强有关〔8〕,而miR-221和miR-222的上调则与PTC的预后不良和复发有关〔9〕。另外,miR-181b和miR-21的下调可能会促进PTC的细胞增殖和侵袭〔10〕。

miRNA可以作为PTC的潜在生物标志物,用于诊断、预后评估和治疗监测。研究表明,特定miRNA的表达模式可以用于区分PTC和甲状腺良性病变,为临床诊断提供了新手段〔11～13〕。此外,一些miRNA也被发现与PTC的预后相关,可以作为预后评估的潜在标志物〔14～16〕。PTC的淋巴结转移是其预后评估中的重要指标之一。研究表明,PTC的淋巴结转移是其常见的临床特征之一〔17,18〕。淋巴结转移的存在与PTC的预后密切相关,可以影响患者生存率和疾病复发率。一般来说,淋巴结转移的程度越大,预后越差〔19〕。研究还发现,淋巴结转移的数量、大小和位置对于预后的评估具有重要意义〔20〕。近年来,有研究发现,一些基因突变和表达异常与PTC淋巴结转移和预后有关〔21～23〕。此外,一些长链非编码(lnc)RNA或环状RNA也可以通过靶向某些miRNA的表达,进而影响PTC增殖、迁移和侵袭,促进淋巴结转移和改变患者预后〔24～26〕。

miR-145作为一种重要的调控分子,参与了多种生物学过程的调节,包括细胞增殖、凋亡和侵袭转移等。在PTC中,miR-145下调可能与肿瘤的恶性程度和预后有关。本研究表明,miR-145可能与PTC的恶性程度及病情严重程度有关,且可能在淋巴结转移过程中发挥了一定调控作用。此外,本研究还提示miR-145可能作为一个潜在的预后标志物和治疗靶点,有助于指导PTC患者的治疗策略和预后评估。然而,本研究还存在一些限制:首先,本研究是基于单一中心的回顾性研究,可能存在选择偏倚;其次,本文样本量相对较小,需要进一步扩大样本量以验证。