丙戊酸钠促进神经根回植术后神经元存活的机制研究

吴殿秀,袁依然,杨丽娟,王海鹏

(1.北华大学基础医学院,吉林 吉林 132013;2.北华大学临床医学院,吉林 吉林 132011)

臂丛根性撕脱伤是上肢致残率较高的一种损伤,撕脱的范围可以是一个、多个甚至是全部臂丛,由于轴突接近胞体撕裂,可导致神经胞体的大量死亡[1]。为代替死亡神经元的功能,NANDHANA M等[2]通过肋间神经和副神经等移位、游离及移植肌肉,恢复和重建了部分肢体功能,但手术过程不可避免地牺牲部分组织供区功能,而且术后功能恢复并不理想,目前,在脊髓水平上的神经修复-神经根回植术成为国内外学者的研究热点。CHAI H[3]研究发现,通过神经根回植术不但能增加神经元存活率,而且存活下来神经元80%以上会再生出轴突长入回植的神经根。

丙戊酸钠是一种不含氮的广谱情绪稳定剂,应用于临床上治疗癫痫已有30多年的历史。有研究[4-5]表明,丙戊酸钠不仅具有保护神经元的作用,而且还可以促进轴突的生长。本试验在大鼠臂丛神经撕脱伤的基础上给予神经根回植术治疗,通过是否服用丙戊酸钠,比较单一手术治疗与手术联合药物治疗对神经元保护作用的差别。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

SPF级成年雄性Wistar大鼠(吉林大学基础医学院动物实验中心)155只,体质量200～250 g;将大鼠随机分为空白组(5只)、手术组(75只)、丙戊酸组(75只);手术组和丙戊酸钠组按照术后不同时间点分为1、2、3、7、14 d 5个亚组,每个亚组15只。

主要试剂:TUNEL试剂盒(罗氏公司,瑞士);Bcl-2抗体(Abcam公司,英国);实时荧光定量试剂盒(FastStart Universal SYBR SYBR Green Master,ROX公司,瑞士);反转录试剂盒(M-MLV,Fermentas公司,英国);总RNA提取试剂盒(PolyA Ttract®mRNA Isolation System Ⅲ Promega,Madison,MA,Promega公司,美国);蛋白质电泳分子量Marker(Takara公司,日本)。

1.2 实验方法

模型制备:应用10%水合氯醛(0.25 mL/100 g)对大鼠行腹腔注射麻醉,将大鼠俯卧位固定于无菌手术操作台上,剃毛器剔除颈后及上背部鼠毛,常规消毒。以C6为中心,取颈背部后正中长约3 cm切口,以突出的T2棘突为定位标志(棘突最高),将肌肉组织向两侧牵开,显露C5、C6椎板,咬除相应棘突和右侧半椎板,显露脊髓及C6神经根。将锐利刀片靠近脊髓,小心切断神经根,再用刀片作约3 mm深脊髓横行切口,将C6神经前根回植入脊髓前角,无创缝线缝合2针固定,后根旷置,缝合切口,待动物清醒后分笼饲养。丙戊酸组大鼠术后用丙戊酸钠300 mg/(kg·d)的水代替正常饮水饲养。

取材:随机选取10只大鼠,麻醉后,双侧眼球摘除法放血处死,取手术侧C6节段脊髓,-80 ℃冷冻保存(5只用于实时荧光定量PCR检测,5只用于Western blot检测)。剩余5只大鼠用肝素盐水混合物(肝素12 500 U+100 mL生理盐水)灌注、冲洗组织血管里的血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。切取C6节段脊髓,浸于4%多聚甲醛缓冲液固定,脱水后用石蜡包埋,制作厚度约为3 μm的连续横断切片(用于TUNEL检测)。空白对照组5只大鼠按照PCR检测要求进行取材。

TUNEL法检测:按照试剂盒说明染色后在200倍显微镜下观察,神经核染为棕黄色的判定为阳性凋亡细胞。计数右侧(手术侧)阳性的神经元,计数左侧(正常)胞体清晰、苏木精染成蓝色胞核神经元。凋亡神经元百分比为右侧凋亡神经元数目与左侧正常神经元数目的比值。

Western blot检测:提取大鼠脊髓中的蛋白质,检测样品蛋白质含量。通过SDS-PAGE电泳、转膜、抗原抗体反应后进行显色、曝光,最后将获得的胶片进行凝胶图像分析。将胶片进行扫描或者拍照,用图像处理系统分析目标条带的灰度值,与内参灰度值的比值作为表达指数。

实时荧光定量PCR检测:提取出大鼠脊髓总RNA后,定量RNA浓度与纯度,根据试剂盒说明反转录得到cDNA,并以其为荧光定量模板(引物见表1),用Applied Biosystems荧光定量PCR仪进行扩增,采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对含量。

表1 PCR引物

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 神经元凋亡情况

本研究结果显示,神经根回植术后第1、2天各组内未发现凋亡神经元,术后第3～14天手术组与丙戊酸组有凋亡神经元存在。在第3、7天丙戊酸钠组凋亡的神经元百分率低于手术组(P<0.05),而在第14天两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 神经元凋亡百分率

2.2 Bcl-2的蛋白表达情况

本研究结果显示,神经根回植术后,手术组与丙戊酸钠组Bcl-2的蛋白表达逐渐升高,第7天后表达降低。丙戊酸钠组较手术组Bcl-2的蛋白表达在术后第2、3、7天均明显升高(P<0.05),但术后第1、14天比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3、图1。

图1 TUNEL 染色凋亡神经元Fig.1 Apoptotic of neurons detected by TUNEL

表3 Bcl-2 Western blotting 条带IOD标准化值

2.3 Bcl-2的mRNA 表达情况

本研究结果显示,神经根回植术后手术组与丙戊酸钠组Bcl-2的mRNA 表达逐渐增高,第7天后的mRNA表达降低(P<0.05)。丙戊酸钠组较手术组Bcl-2的mRNA表达在术后第2、3、7 天明显增高(P<0.05),术后第1、14天mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表4。

图2 Bcl-2 Western blotting条带Fig.2 Bcl-2 Western blotting bands

表4 Bcl-2 的mRNA表达

3 讨 论

臂丛根性撕脱伤虽不会危及生命,但可引起上肢严重伤残。伤后治疗是迄今为止国内外手外科、神经外科的难题之一。随着医疗技术的发展,神经移位术、肌肉关节功能重建等多种治疗方法被应用于临床[6-7],但由于受可供移植和转位的神经有限、移位神经后大脑功能重塑及供区功能受损等多种原因影响,术后肢体功能恢复难以达到满意效果。有学者[8]发现,节前根性撕脱伤的损伤位置由于更接近胞体,导致脊髓内部大量神经元死亡,所以单纯修复术后神经纤维失去了“原动力”再生,损伤较重者根本无法再修复。CHAI H 等[3]发现,臂丛根性撕脱伤后应用神经根回植术可以减缓伤侧肌肉萎缩,增加肌纤维横截面积,恢复肌肉电生理学特征。HOANG T X等[9]发现单个神经根回植可以促进多个脊髓损伤节段内的神经元存活。HTUT M等[10]将神经根回植手术应用于临床治疗,证实神经根回植术可以有效地保护运动神经元,并促进神经纤维再生,但其具体机制还有待进一步研究。有研究[4,11]发现,小分子物质丙戊酸钠可以通过血脑屏障直接到达损伤处保护臂丛根性撕脱伤后的神经元。本试验通过神经根回植术联合应用丙戊酸钠即手术联合药物的方法治疗神经根撕脱伤,通过TUNEL染色证实丙戊酸钠可以在神经根回植术的基础上进一步减少神经元的凋亡。

Bcl-2是公认的具有强大抑制凋亡作用的基因,它可以通过抑制Ca2+从内质网内释放、调节Ca2+从内质网到线粒体的再次分布及浓度波动、抑制线粒体释放元色素C而减少神经元凋亡[12],也可以通过抑制第二种线粒体来源的激活剂或低等电点IAP结合蛋白保护神经元免受自由基侵害的作用。NATSUME A等[13]发现,L4-6根性撕脱伤大鼠Bcl-2可有效增加脊髓前角神经元存活数量,YUAN P X[14]发现,丙戊酸可以通过增加Bcl-2和GAP-43的表达保护神经元。本试验通过Western blot及实时荧光定量PCR技术检测结果显示,臂丛撕脱伤后应用丙戊酸会诱导Bcl-2的蛋白及mRNA表达增加,同理可推断丙戊酸可以通过增加脊髓内Bcl-2的基因表达来抑制神经元的凋亡,从而促进受损神经元的存活。

综上所述,在大鼠臂丛根性撕脱伤后早期进行神经根回植联合丙戊酸钠治疗,可增加Bcl-2的蛋白及mRNA表达,有利于损伤神经元的存活,本研究可为后期臂丛根性撕脱伤的临床治疗提供新的思路和方法。