miRNA-758-3p对口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

张 越,杨 超

(北华大学附属医院,吉林 吉林 132011)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一。在2020年全球报告了超过10 000例OSCC新发病例,导致5 000人死亡[1]。当前用于治疗OSCC的疗法包括手术、化学疗法和放射疗法[2]。虽然在诊断和临床治疗的OSCC已经取得进展,但由于疾病的进展和复发,OSCC患者的5 a生存率仍然相对较低[3-4]。因此,确定潜在的生物标志物对改善OSCC的预后和制定治疗策略至关重要。

微小RNA(miRNA/miR)是一类非编码RNA,转录后通过识别靶向mRNA的3′非翻译区(3′-UTR)的互补序列调节基因表达[5-6]。miRNA在多种生物学过程中发挥重要功能,包括发育、细胞增殖和凋亡[7-8]。研究[7,9-14]发现,几乎在多种癌症中均观察到miRNA的表达失调,包括肾癌、结直肠癌、肝癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌和乳腺癌等,miR-758-3p可以抑制肿瘤的发生发展。研究[15-16]发现,miR-758-3p通过靶向MDM2和MTER抑制肝细胞癌的进展。miR-758-3p通过靶向MEPE调节子宫颈浸润癌的发展。然而,目前尚未有研究报道miR-758-3p在OSCC中的生物学功能。因此,本研究通过检测miR-758-3p在OSCC中的表达,探究miR-758-3p对CAL27细胞增殖、迁移及侵袭的影响,旨在为OSCC的治疗提供新的靶标。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

正常牙龈上皮细胞及OSCC细胞系(CAL27、SCC9和SCC25,上海斯信生物科技有限公司);miR-758-3p和miR-NC(上海吉玛制药技术有限公司);Lipofectamine 2000转染试剂、BCA蛋白检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);反转录试剂盒(深圳晶美生物工程有限公司);MMP2、MMP9抗体(北京中杉金桥生物试剂公司)。

1.2 细胞培养与转染

在含有10%FBS的DMEM(Gibco; Thermo Fisher Scientific,Inc.)中培养HGE细胞和CAL27细胞;将HGE细胞和CAL27细胞接种于6孔板中,采用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照说明书转染至相应细胞内。

1.3 RT-qPCR

应用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA;应用NanoDrop分光光度计测定RNA纯度和浓度;应用BcaBest RNA PCR Kit(TaKaRa公司,日本)将总RNA反转录为cDNA;应用SYBR Green染料在BIO-RAD T100实时PCR系统上进行定量RT-PCR(qRT-PCR),以确定基因表达,使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的表达水平。将U6 miRNA和GAPDH作为内参,PCR引物由上海生工合成,引物序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列Tab.1 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 WST-1

将各组细胞在96孔板中培养,在48 h后加入10 μL的WST-1试剂,在温度为37 ℃、5%CO2的恒定环境下孵育1 h,在4个时间点(0、24、48、72 h)应用酶标仪检测仪测定450 nm处的吸光度。

1.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭试验

细胞迁移试验:将转染后的CAL27细胞饥饿12～24 h后,收集细胞悬液,计数后加入Transwell小室,将Transwell小室放入24孔板; 24 h后拿出小室,去除培养基,用4%多聚甲醛固定15 min;0.1%结晶紫溶液染色15 min;取出小室,清洗干净后,显微镜下观察计数。

细胞侵袭试验:先将Transwell小室的聚碳酸酯膜上室铺上一层Matrigel基质胶,之后重复细胞迁移试验的步骤。

1.6 Western Blot印迹实验

细胞转染后收集细胞,提取总蛋白。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白,然后转移至PVDF膜,用5%脱脂奶封闭后,一抗TRIM44(1∶1 000)4 ℃孵育过夜,二抗(1∶5 000)室温1 h。采用ECL发光液进行显色及成像分析。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 HGE细胞与OSCC细胞系中miR-758-3p的PCR表达情况

RT-qPCR结果表明,与HGE细胞比较,TSCC细胞系CAL27、SCC9和SCC15中miR-758-3p表达下调(P<0.05),其中CAL27细胞中miR-758-3p表达量最低,因此,选择CAL27细胞进行后续试验(见图1)。

图1 OSCC细胞系及HGE细胞中miR-758-3p表达水平Fig.1 Expression levels of miR-758-3p in OSCC cell lines and HGE cells

2.2 miR-758-3p过表达抑制OSCC细胞CAL27的增殖活性

将过表达miR-758-3p和miR-NC转染至CAL27细胞中,转染后,细胞培养48 h,通过RT-qPCR验证miR-758-3p的表达水平。RT-qPCR结果表明,与miR-NC组CAL27细胞中miR-758-3p表达水平(0.97±0.12)比较,miR-758-3p组表达水平(5.48±0.31)明显增高(见图2 a)。WST-1分析显示,miR-758-3p过表达能显著抑制CAL27细胞的活力(P<0.05)(见图2 b)。

a

2.3 miR-758-3p过表达能抑制OSCC细胞CAL27的迁移和侵袭

Transwell试验结果显示,与miR-NC对照组比较,miR-758-3p组细胞迁移数量显著减少(P<0.05)(见图3 a);与miR-NC对照组比较,miR-758-3p组细胞侵袭数量显著减少(P<0.05)(见图3 b)。

a

2.4 miR-758-3p过表达对CAL27细胞中MMPs蛋白表达的影响

Western Blot结果显示,与miR-NC组比较,miR-758-3p组CAL27细胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表达显著下降(P<0.05)。见图4。

a MMP-2与MMP-9蛋白表达水平

3 讨 论

有研究[17-19]发现,多种miRNA在健康人和OSCC患者之间存在差异表达,miRNA在多种人类肿瘤的病理过程中起关键的调节作用。miRNA通过调节靶基因的表达,对各种细胞生物学功能产生影响,例如细胞生长、发育和增殖。同时,miRNA通过调节基因转录参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移[20],唾液miR-139-5p是OSCC治疗反应和复发评估很有价值的生物标志物[18]。CALIN G A等[20]报道,miR-124-3p通过降解极光激酶A的mRNA可以抑制膀胱癌的生长和转移。在OSCC进展中有更多miRNA被作为诊断或预后的生物学指标[18-19]。与正常组织比较,miR-758-3p在多种癌组织中的表达显著降低,例如膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌等。本研究结果显示,miR-758-3p在 OSCC细胞中呈低表达,并且在CAL27细胞系中表达最低,提示miR-758-3p表达量与OSCC的病情进展程度具有相关性。

为探究miR-758-3p在OSCC发生发展中的作用机制,本研究将 miR-758-3p mimics转染到CAL27细胞内,发现miR-758-3p过表达能显著抑制CAL27细胞增殖,并降低其活性,还能降低CAL27细胞的迁移及侵袭的能力。Western Blot结果提示,miR-758-3p过表达可以明显抑制CAL27细胞中MMP-2及MMP-9的蛋白表达,提示miR-758-3p可能是OSCC潜在作用靶点,miR-758-3p在CAL27细胞中作为肿瘤抑制因子,可作为OSCC患者恶性程度的指标之一。

综上所述,miR-758-3p在OSCC细胞中呈低表达,并且在CAL27细胞中表达最低,上调miR-758-3p可以抑制OSCC细胞的迁移和侵袭,表明miR-758-3p可能是OSCC治疗的靶标。