基于罗汉果治疗糖尿病肾病机制的网络药理学和分子对接分析

于 洋, 田 丹, 倪东贺, 张 铎

（北华大学附属医院医学影像中心，吉林 吉林 132011）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是导致终末期肾病的重要原因［1］，临床表现有蛋白尿、水肿、高血压、贫血和肾功能异常等，其中持续性蛋白尿和（或）肾小球滤过率降低为DN 的主要临床特征［2］。近年来，DN 的发病率随糖尿病发病率升高而递增。预计至2045 年，全世界糖尿病患者将增至6.93 亿［3］，其中有 30%～40%的糖尿病患者将会伴有DN［4］。目前，我国是全球成人糖尿病患者人数最多的国家，患病率达10.4%，且20%～40%2 型糖尿病患者伴有DN［5-6］，并呈上升趋势。DN可导致肾脏滤过系统障碍，最终导致肾衰竭甚至危及生命，但目前国内外对DN 尚无最佳治疗方案。罗汉果属葫芦科罗汉果属攀援草本植物［7］，有清肺利咽、化痰止咳和润肠通便的功效，主治咳喘、咽痛和便秘等病症，且具有突出的降糖效果［8］，但采用罗汉果治疗DN 的研究尚未见报道。

网络药理学作为一种新兴的研究技术在中药机制的研究中被广泛应用［9］，通过建立靶点-药物-疾病三者之间的联系，为研究中药药效提供了新的途径，为深入研究中药活性成分及其作用机制提供帮助［10-13］。本研究利用网络药理学对罗汉果抗DN 的主要活性成分及潜在的分子作用机制进行分析，为进一研究DN 的治疗药物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 罗汉果小分子化合物信息以 “罗汉果”为关键词，通过搜索中药系统药理数据库和分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https：//old. tc msp-e. com/tc msp.php）及文献检索，共收集到182 种成分信息。本研究入选标准： 口服生物利用度 （oral bioavailability，OB） 为30%，药物相似度（drug likeness，DL）为0.18［14］。结果中共同符合OB≥30%和DL≥0.18 且有作用靶点的成分被认为是罗汉果的活性成分。符合条件的化合物共有5 种。

1.2 罗汉果潜在作用靶点采用TCMSP 数据库中CancerHSP 软件对罗汉果5 种化合物进行作用靶点的检索，利用小分子药物靶点预测数据库对罗汉果5 种重要成分进行靶点信息分析。通过Uniprot数据库中Retrieve/ID mapping 软件将靶点信息中的Uniprot ID 转为基因名称，以便后续分析。

1.3 检索 DN 相关靶点通过 DisGeNET（https：//www. disgenet. org） 和 GeneCards（https：//www.genecards.org）数据库，检索和过滤关键词“糖尿病肾病”［15］。2 个数据库中重复的目标保留1 次，筛选出的共同目标作为DN 目标用于后续分析。所得数据通过Venny数据库进行对照，绘制成韦恩图，并检索得到交集靶点，进行下一步分析。

1.4 构建蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络将韦恩图得到的交集靶点基因集输入到STRING 数据库（https：//Stringdb.org/），将最低互动分数设置为0.9，此时代表最高置信度。导出蛋白两两互作关系对，再导入到Cytoscape（3.8.2 版本） 软件进行可视化，绘制PPI 网络图。利用Cytoscape 软件的内置插件Cytohubba 计算每个蛋白节点的连接度（Degree），取Degree 值排名前10 位的蛋白作为核心靶点。

1.5 罗汉果作用于DN 潜在靶点基因本体论（Gene Ontology， GO）功能和京都基因与基因组百科 全 书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析对“1.3”中得到的交集靶点进行GO 功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，预测交集靶点的潜在功能。其中，GO 分析基于生物过程（biological process，BP）、细胞成分（cell component，CC） 和分子功能（molecular function，MF）3 个维度来构建基因注释，KEGG 是理解基因之间高级功能和相互作用的数据库资源。采用R 语言的ClsterProfiler 程序包进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，并运用dotplot 和ggplot2 函数对GO 功能和KEGG 信号通路的富集结果进行可视化。

1.6 分子对接技术预测DN 核心靶点与罗汉果主要活性成分的结合能力在RCSB 数据库中下载PPI 中核心蛋白的pdb 格式文件，在TCMSP 数据库中下载罗汉果主要活性成分的mol2 格式文件。在本研究中，为了进一步探索DN核心靶点与罗汉果主要活性成分相互作用的机制，采用AutoDock 4.2 软件构建了罗汉果主要活性成分与核心基因的分子对接模型，并采用PyMOL 软件对结果进行可视化。

2 结 果

2.1 罗汉果活性成分分析通过TCMSP 数据库分析罗汉果中含有182 种成分，符合筛选条件共有11 个候选活性成分，去除6 个对基因无效的成分，得到5 个罗汉果有效活性成分。见表1。

表1 罗汉果中5 种活性成分Tab.1 Five active ingredients of monk fruit

2.2 罗汉果活性成分的作用靶点采用TCMSP数据库获取罗汉果中5 种活性成分靶点的Uniprot ID，通过Uniprot 数 据 库将罗汉果的Uniprot ID 转化为对应的Gene Name。通过CancerHSP 软件检索，得到罗汉果作用靶点114 个，采用Excel 软件筛选去除重复项得到78 个非重复性作用靶点。录入Cytoscape 3.10.1 软件，得到罗汉果潜在作用靶点网络图（图1）。图中蓝色节点为罗汉果活性成分，与蓝色节点连接的为罗汉果活性成分作用的靶点。ZINC03860434、beta-sitosterol 和 Kaempferol 3 种活性成分周围放射线密集，密集程度与靶点数量成正比，表明上述3 种化学成分可能是罗汉果主要的活性成分。

图1 罗汉果活性成分潜在治疗靶点网络图Fig. 1 Network diagram of potential therapeutic targets of active ingredients of monk fruit

2.3 罗汉果活性成分与DN 的交叉靶点从GeneCards 和DisGeNET 2 个网站上筛选DN 相关基因，GeneCards 数据库搜索出3 581 个DN 靶点，DisGeNET 数据库搜索出1 190 个DN 靶点。利用Venny 数据库，将罗汉果作用靶点与DN 靶点进行相互筛选，得到34 个交集靶点和对应的韦恩图。见图2。

图2 罗汉果活性成分与DN 的交叉靶点韦恩图Fig. 2 Venn diagram of active ingredients of monk fruit and cross target of DN

2.4 构建公共基因PPI 网络将34 个靶点输入STRING 数据库构建PPI 网络（图3）。 利用Cytoscape3. 9. 1 软件中Network Analyzer 工具进行分析，得到PPI 网络靶点22 个（表2）。网络图中的蓝色圆点代表靶点蛋白，靶点之间的相互作用关系由蓝色虚线表示。利用Cytoscape3. 9. 1 软件中 cytoHubba 工具进行数据分析，得到相关性排名前5 位的靶点，其中颜色越深代表相关性越强，分别为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1 （serine/threonine protein kinase 1，AKT1）、转录因子RELA、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JUN）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF） 和B 细胞κ-轻肽基因增强子抑制因子激酶β（inhibitor ofkappa-lightpolypeptidegeneenhancerin B-cells kinase beta，IKBKB）（图4），其中排名前4 位的靶点均与炎症相关，表明罗汉果在DN 治疗过程中发挥重要的抗炎作用。

图3 罗汉果和DN 的PPI 网络图Fig. 3 PPI network diagram of monk fruit and DN

图4 PPI 网络中综合排名前5 位的靶点Fig. 4 Top 5 comprehensive ranking targets in PPI network

表2 PPI 网络靶点和拓扑参数Tab.2 PPI network targets and topological parameters

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析结果通过Venny 数据库筛选得到罗汉果与DN 的34 个交集基因，进行GO 功能富集分析得出罗汉果治疗DN 的关键靶点，GO 功能柱状图见图5，纵坐标表示基因名称，横坐标表示基因数，柱状图长短表示相关基因数，不同颜色表示P值大小。MF 包括脂多糖活性和氧化应激活性等；CC主要包括膜筏和质膜筏等；BP 主要涉及活性氧和氧化应激。GO 功能富集分析结果显示：罗汉果治疗DN 与抗炎有密切联系。KEGG 信号通路富集气泡图见图6，横坐标为基因比例，纵坐标为基因名称，不同颜色表示P值大小。KEGG 信号通路分析结果显示：罗汉果改善DN 过程中主要涉及晚期糖基化终末产物 （advanced glycosylation end product， AGE）-AGE 受体（receptor of AGE，RAGE）信号通路和TNF 信号通路等。

图5 罗汉果治疗DN 关键靶点GO 功能富集结果柱状图Fig. 5 Histograms of GO functional enrichment results of key targets of monk fruit in treatment of DN

图6 罗汉果治疗DN 关键靶点KEGG 信号通路富集分析气泡图Fig. 6 Bubble map of KEGG signaling pathway enrichment analysis on key targets of monk fruit in treatment of DN

2.6 罗汉果主要活性成分与核心靶点的分子对接验证在“2.4”中得出PPI 网络排名前5 位的核心蛋白分别为AKT1、 RELA、 JUN、 TNF 和IKBKB，根据图1 中的连接关系，其对应的罗汉果的活性分子分别为MOL000422 （Kaempferol）、MOL000422（kaempferol） 、MOL000422（kaempferol）、 MOL000422 （Kaempferol） 和MOL000358 （beta-sitosterol）。采用AutoDock 软件进行分子对接，供体与受体间的分子结合能和位点氨基酸残基信息结果见表3，采用PyMOL 软件进行可视化，结果见图7。当蛋白和小分子之间结合能为-4.25～-5. 00 kJ·mol-1时，具有一定的结合活性；结合能为-5.00～-7.00 kJ·mol-1时，结合活性较好；结合能＜-7.00 kJ·mol-1时，结合活性较强。本研究中5 种分子对接结合能均在-8.00～ -5.00 kJ·mol-1之间，表明二者之间结合活性较好且较强。

图7 罗汉果主要活性成分与DN 靶点蛋白分子对接结果Fig. 7 Results of molecular docking between main active ingredients of monk fruit and DN target proteins

表3 罗汉果主要活性成分与核心靶点分子对接结合能和结合位点Tab. 3 Binding energy and binding sites between molecular docking of main active ingredients of monk fruit and key targets

3 讨 论

DN 被认为是糖尿病最严重的并发症，是导致肾功能衰竭的主要原因［16-17］。DN 具有发病率高和预后差等特点，给患者、家庭和社会带来巨大的经济负担和身心压力［18］。尽管临床中DN 的治疗已取得一定的进展，但治疗效果仍不能满足临床需求，进一步开发新药非常必要。中药由于其成分多、靶点多和干预路径多的特点，在DN 治疗过程中表现出特有的优势。

罗汉果作为道地的药材，在降糖和抗炎等方面具有良好的药理作用。罗汉果多糖能够抑制高迁移 率 族 蛋 白 B1 （high mobility group protein B1，HMGB1）/Toll 样受体4 （Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路进而改善小鼠DN 损伤，罗汉果多糖可治疗DN［19］。

本研究利用网络药理学方法对罗汉果在DN 中活性成分和作用靶点进行分析，结果显示：罗汉果在TCMSP 数据库中信息较少，符合OB 和DL 筛选要求并且有干预靶点的活性成分有5 个，其中Kaempferol 的作用靶点最多，包括JUN、TNF 和AKT1 等，表明其参与的生物学过程最多。罗汉果中活性成分大多为酮类化合物。研究［20-23］显示：酮类化合物可以抑制相关糖异生表达、抗氧化应激、抗炎和抗肿瘤等。本研究中，5 种活性成分对85 个目标靶点有干预效果，其中与DN 相关的靶点有34 个，GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析结果显示：罗汉果对DN 的改善机制与炎症有密切关联，TNF 炎症通路可能是罗汉果改善DN 的主要机制之一。研究［7，24］显示：慢性炎症在DN 发生发展过程中起主要作用。肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α） 是一种具有促炎作用的细胞因子，主要由单核细胞、巨噬细胞和T 淋巴细胞产生［25］，是TNF 信号通路的重要靶点之一。BAUD 等［26］研究显示：TNF-α 可引起肾小球内血流和滤过率的改变，并改变内皮通透性。研究［27-29］显示：TNF-α 可改变参与细胞间黏附受体的位置，防止F-肌动蛋白应激纤维的形成，从而导致细胞间连接的改变，继而导致内皮通透性丧失。因此，TNF-α 是DN 发生发展过程中的重要参与因子。

综上所述，本研究采用网络药理学方法分析罗汉果抗DN 的活性成分和作用靶点，结果表明：Kaempferol 是罗汉果中对DN 最有效的活性成分，其作用机制主要与TNF 等炎性通路有关。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

于洋参与研究设计、数据采集及分析和论文撰写，田丹和倪东贺参与论文校对和实验研究，张铎参与论文指导和审校。