PD-L1 对人口腔鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

曾 洁, 俞雪燕, 罗 婷, 徐 江

（1. 石河子大学第一附属医院口腔科，新疆 石河子 832000；2. 石河子大学第一附属医院病理科，新疆 石河子 832000；3. 新疆维吾尔自治区儿童医院检验科，新疆 乌鲁木齐 830000）

口 腔 鳞 状 细 胞 癌 （oral squamous cell carcinoma， OSCC） 约占口腔癌的90%，是一个严重的全球健康问题，也是世界范围内重大的公共健康威胁［1-2］，其5 年生存率仅为30%，局部和远处转移及局部复发是OSCC 患者不良预后的主要影响因素［3］，因此研究OSCC 的发生发展机制和寻找新的诊疗靶标至关重要。

程序性细胞死亡配体1 （programmed cell death-ligand 1，PD-L1）常与程序性细胞死亡受体1 （programmed cell death receptor-1，PD-1） 相互作用，进而导致针对肿瘤细胞的免疫应答失活［4］。研究［5-6］显示：PD-L1 在多种癌症中过表达，如黑色素瘤、肾上腺皮质癌和脑肿瘤等，并与患者的预后呈负相关关系。田国永等［7］研究发现：PD-L1在OSCC 组织中高表达，其高表达可缩短患者的生存期，并与淋巴结转移等有关。但关于PD-L1 在OSCC 中发挥作用的具体分子机制尚未完全阐明。本研究探讨PD-L1 在OSCC 细胞系中的表达，通过敲低PD-L1 表达分析其对OSCC CAL27 细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响，为OSCC的诊断和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器口腔上皮HOK 细胞购自河北北纳生物科技有限公司， OSCC CAL27 和SCC15 细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）细胞库，OSCC TCA8113 细胞购自上海吉凯基因医学科技有限公司。兔抗PD-L1 单克隆抗体购自美国Abcam 公司，β-actin 抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG、辣根酶标记山羊抗鼠IgG 和山羊抗兔IgG/FITC 二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，CCK-8 试剂盒购自米鼠（西安）生物科技有限公司， 小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）片段购自苏州吉玛基因股份有限公司，引物序列见表1。

表1 PD-L1 siRNA 引物序列Tab. 1 Primer sequences of PD-L1 siRNA

1.2 Western blotting 法检测口腔上皮HOK 细胞和OSCC 细胞中PD-L1 蛋白表达水平收集生长状态良好的HOK、CAL-27、SCC-15 和TCA8113细胞，采用RIPA 裂解液分离总蛋白，蛋白定量后，将总蛋白（约0.8 g）上样进行SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜，无蛋白快速封闭液封闭15 min，采用稀释的一抗PD-L1 （1∶1 000） 和β-actin（1∶5 000） 4 ℃下孵育过夜。隔天采用含0.2%吐温的TBS（TBST）洗涤6次，每次5 min，将膜与二抗山羊抗兔IgG（H+L）-HRP（1∶15 000）和山羊抗鼠IgG（H+L）-HRP（1∶20 000）孵育2 h，再次将膜洗净，采用蛋白成像系统（Tanon5200）检测蛋白条带灰度值，采用Image J 软件进行灰度值分析，计算细胞中PD-L1 蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值。

1.3 免疫荧光染色法检测CAL27 细胞中PD-L1 蛋白表达和定位情况常规培养HOK 和CAL27 细胞，12 孔细胞培养板爬片，培养24 h 后细胞密度为60%～70%，1×PBS 缓冲液漂洗2 min，共3 次，室温下多聚甲醛固定15 min，再次1×PBS缓冲液漂洗，0.2%Triton-X-100 透化3 min，1×PBS 缓冲液洗净，37 ℃条件下采用5%BSA 封闭30 min，吸尽封闭液后加入一抗PD-L1（1∶500），4 ℃湿盒内孵育过夜。第2 天室温下复温30 min，PBS 缓冲液洗净，暗室内孵育二抗（1∶50）2 h，PBS 缓冲液漂洗，DAPI 染核30min 后立即用抗荧光淬灭剂封片，倒置荧光显微镜下观察PD-L1 蛋白表达和定位情况并拍照，其中绿色荧光代表PD-L1 蛋白表达。

1.4 CAL27 细胞分组和转染取对数生长期CAL27 细胞分为对照组（转染si-NC）和si-PD-L1组（转染si-PD-L1），消化离心后于6 孔细胞培养板内铺板，保证培养24 h 后细胞密度约为70%，PBS 缓冲液洗净后加入2 mL 无血清培养基，分别加入Lipofectamine 2000 和PD-L1 siRNA 混匀的转染试剂，静置15 min，加入弃去原培养基且PBS 缓冲液洗净的6 孔细胞培养板中，培养4～6 h 后直接更换为完全培养基，48 h 转染结束后收集细胞，进行后续研究。

1.5 CCK-8 法检测2 组CAL27 细胞增殖活性细胞分组见“1.4”。细胞转染后，以每孔2 000 个细胞的密度铺板于96 孔细胞培养板中，每组至少3 个复孔，最边缘孔加入PBS 缓冲液，37 ℃培养2 h 使细胞贴壁，避光条件下每孔加入CCK-8 试剂10 μL，继续培养24、48、72 和96 h，采用分光光度计检测波长450 nm 处吸光度（A）值，重复测量3 次，计算平均值，以A 值平均值表示细胞增殖活性。

1.6 平板克隆形成实验检测2 组CAL27 细胞克隆形成率细胞分组见“1.4”。6 孔细胞培养板中每孔加入3 000 个细胞，每组重复3 孔，37 ℃继续培养10 d 终止，PBS 缓冲液温和洗涤3 次，4%冰多聚甲醛固定15 min，PBS 缓冲液再次温和洗涤，4 ℃冰箱内结晶紫染色15 min，PBS 缓冲液洗净多余染色，晾干后拍照。细胞克隆计数的标准为显微镜下每个克隆含有的细胞数大于50 个。

1.7 细胞划痕实验检测2 组CAL27 细胞划痕愈合率细胞分组见“1.4”。6 孔细胞培养板中接种细胞，确保第2 天细胞密度达90%以上，200 μL 无菌枪头竖直划痕，PBS 缓冲液轻轻洗除划痕细胞，加入无血清培养基继续培养，0、24 和48 h 时显微镜下观察拍照，采用Image J 软件计算划痕部位的迁移面积，并计算划痕愈合率。划痕愈合率=（起始划痕面积-迁移后划痕面积）/起始划痕面积×100%。

1.8 Transwell 小室实验检测2 组CAL27 细胞中迁移和侵袭细胞数细胞迁移实验：于Transwell 小室上层加入5×104个悬浮于200 μL 无血清培养基的细胞，在下室添加600 μL 完全培养基，培养24 h后，取出小室，PBS 缓冲液洗涤2 次，冰甲醇固定20 min，然后用0.5%结晶紫室温染色30 min，棉签轻轻擦拭小室内部并晾干，显微镜下观察染色细胞并随机选取5 个视野进行细胞计数，5 个视野迁移细胞数均值即为迁移细胞数，代表细胞迁移能力。 细胞侵袭实验： 将Matrigel 基质胶加入Transwell 小室内均匀平铺，然后将小室置于37 ℃培养箱静置2 h，使胶充分凝固，取出小室，小心吸去上层液体，再加入100 μL 无血清培养基，继续在37 ℃培养箱中静置30 min，使胶充分水化，再次吸尽小室上层液体，后续实验步骤和侵袭细胞计数同细胞迁移实验。

1.9 统计学分析采用SPSS 26.0 和GraphPad Prism 9.0 统计软件进行统计学分析。细胞中PD-L1 蛋白表达水平、细胞增殖活性、克隆形成率、划痕愈合率、迁移细胞数和侵袭细胞数均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验，2 组间样本均数比较采用两独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 OSCC 细胞中PD-L1 蛋白表达水平及CAL27细胞中PD-L1 蛋白表达和定位情况与HOK 细胞比较，CAL27、SCC15 和TCA8113 细胞中PD-L1蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。CAL27 细胞中PD-L1 蛋白表达水平最高，且CAL27 易培养，生长分裂增殖快，细胞状态佳，故选择CAL27 细胞进行后续实验。免疫荧光染色显示：CAL27 细胞的细胞质和细胞核中均有PD-L1 表达，与HOK 细胞比较，PD-L1 在CAL27细胞的细胞质中表达较强。见图1 和2。

图1 Western blotting 法检测不同细胞中PD-L1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 1 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expression of PD-L1 protein in different cells detected by Western blotting method

图2 HOK 细胞和CAL27 细胞中PD-L1 蛋白表达情况（免疫荧光，×200）Fig. 2 Expression of PD-L1 protein in HOK cells and CAL27 cells (Immunofluorescence,×200)

2.2 2 组CAL27 细胞中PD-L1 蛋白表达水平与对照组比较，si-PD-L1 组细胞中PD-L1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），表明si-PD-L1 在CAL27细胞中干扰有效。见图3。

图3 Western blotting 法检测2 组CAL27 细胞中PD-L1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 3 Electrophoregram （A）and histogram（B） of expression of PD-L1 protein in CAL27 cells in two groups detected by Western blotting method

2.3 2 组CAL27 细胞增殖活性和克隆形成数CCK-8 作用24、48、72 和96 h 后，与对照组比较，si-PD-L1 组CAL27 细胞增殖活性明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。平板克隆形成实验结果显示：与对照组（534.2个±4.3个）比较，si-PD-L1 组CAL27 细胞克隆形成数（257.8 个±2.5 个）明显减少（P＜0.01）。见图4 和5。

图4 CCK-8 法检测不同时间点2 组CAL27 细胞增殖活性Fig. 4 Proliferation activities of CAL27 cells in two groups at different time points detected by CCK-8 assay

图5 平板克隆形成实验检测2 组CAL27 细胞克隆形成情况(结晶紫)Fig. 5 Clone formation of CAL27 cells in two groups detected by plate clone formation assay（Crystal violet）

2.4 2 组CAL27 细胞划痕愈合率划痕后24 和48 h，与对照组比较，si-PD-L1 组细胞划痕距离更宽，划痕面积更大，划痕愈合率明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见图6 和7。

图6 细胞划痕愈合实验检测2 组CAL27 细胞划痕愈合情况（Bar= 200 μm）Fig. 6 Scratch healing of CAL27 cells in two groups detected by cell scratch healing assay（Bar=200 μm）

图7 2 组CAL27 细胞划痕愈合率Fig. 7 Scratch healing rates of CAL27 cells in two groups

2.5 2 组CAL27 细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数与对照组 （274.2 个±11.4 个） 比较，si-PD-L1 组细胞中迁移细胞数（115.3 个±5.0 个）明显减少（P＜0.01）；与对照组（247.9个±8.2个）比较， si-PD-L1 组 细 胞 中 侵 袭 细 胞 数（154.7 个±13.7 个） 明显减少（P＜0.01）。见图8 和9。

图8 Transwell 小室实验检测2 组CAL27 细胞迁移情况（结晶紫，×100）Fig. 8 Migration of CAL27 cells in two groups detected by Transwell chamber assay(Crystal violet, ×100)

图9 Transwell 小室实验检测2 组CAL27 细胞侵袭情况（结晶紫，×100）Fig. 9 Invasion of CAL27 cells in two groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet, ×100)

3 讨 论

近年来，尽管OCSS 在外科手术和放化疗等综合治疗方面取得了很大的进步，但OSCC 患者的预后仍较差［8］。研究OSCC 发生发展的分子生物学机制，可为OSCC 患者的治疗和预后判断提供理论依据［9］。免疫治疗逐渐成为癌症治疗的有效手段，且抗PD-1/PD-L1 治疗前景良好，PD-L1 已成为免疫肿瘤学中的关键蛋白［10-11］，其与PD-1 的相互作用发生于肿瘤微环境，能够抑制下游信号传导和T 淋巴细胞多种生物学功能，包括细胞活化、增殖和分泌细胞因子等［12］。PD-L1 与肿瘤的进展有紧密关联［13］，但目前关于PD-L1 在OSCC 中作用的报道较少。

为了探讨PD-L1 与OSCC 之间的关系，本研究采用Western blotting 法检测PD-L1 在3 种OSCC细胞中的表达情况，结果显示：在OSCC 细胞中PD-L1 蛋白特异性高表达；免疫荧光染色结果显示：PD-L1 蛋白在CAL27 细胞的细胞质和细胞核中均有表达，且在口腔上皮HOK 细胞中PD-L1蛋白表达较弱，提示PD-L1 有可能参与OSCC 的发生发展过程。为进一步研究PD-L1 是否影响OSCC 细胞的生物学行为，本研究利用siRNA 技术敲低CAL27 细胞中的PD-L1 表达后，细胞的增殖能力减弱，单个细胞克隆形成能力明显减弱，细胞迁移和侵袭能力均降低，本研究结果与ZHENG等［14］研究结果一致。本研究结果表明：PD-L1 通过促进细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭在OSCC中发挥重要作用，提示敲低PD-L1 可能是OSCC的潜在治疗方法。

PD-L1 作为B7 蛋白家族中的一员，在多种肿瘤细胞中发挥重要的调控作用［15-18］。LIU 等［19］发现：PD-L1 可促进乳腺癌细胞的生长，沉默PD-L1可导致乳腺癌细胞自发凋亡和多柔比星诱导的细胞凋亡增加。上调PD-L1 表达可促进胃癌细胞生长［20］，下调PD-L1 表达后胃癌细胞的黏附、迁移和侵袭能力均减弱，并且PD-L1 在胃癌细胞中可以通过上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）促进其侵袭和迁移［21］。QU 等［22］证实：PD-L1 在卵巢癌细胞中高表达，通过特异性siRNA 敲低PD-L1 基因，可抑制卵巢癌细胞的生长和迁移，降低肿瘤的增殖、抑制肿瘤的细胞周期进展和肿瘤的侵袭。在前列腺癌中，上调PD-L1表达可以增强肿瘤微环境中的免疫抑制，从而促进癌症的发生发展［23］。

综上所述，PD-L1 在OSCC 细胞中特异性高表达，敲低PD-L1 表达可以抑制OSCC 细胞的增殖、迁移和侵袭。本研究结果为OSCC 的靶向治疗提供了理论依据，但PD-L1 调控OSCC 生物学行为的具体机制有待进一步研究。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

曾洁参与论文选题、实验设计、数据分析和论文撰写，俞雪燕和罗婷参与实验操作和数据收集，徐江参与论文中统计学分析和论文审校。