姜酮通过激活Nrf2/HO-1 信号通路减轻OGD/R 后氧化应激损伤对HT22 细胞凋亡的抑制作用

侯玮琛, 张桂美, 张舒石

（1. 吉林大学第一医院神经内科与神经科学中心，吉林 长春 130021；2. 吉林省长春市人民医院伽马刀中心，吉林 长春 130051）

缺血性脑卒中是指由于脑动脉狭窄或闭塞和脑供血不足导致的脑组织坏死，是一种急性脑血管疾病，其患病率、致残率、死亡率和复发率均较高［1］。目前，通过在时间窗内及时进行药物溶栓或机械取栓以实现血管再通和急性期改善侧支循环是治疗缺血性脑卒中最关键和最有效的方法。但上述治疗在改善脑缺血半暗带区组织灌注的同时也会造成难以避免的继发性神经损伤，即脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury， CIRI）［2］。CIRI 是缺血性脑卒中后继发性脑损伤的主要原因，可加剧氧化应激损伤、炎症反应和组织水肿等后续病理改变。

CIRI 是涉及多层次、多通路和多靶点的复杂瀑布式级联化学损伤过程，发病机制非常复杂，其中氧化应激损伤是重要机制之一［3］。核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是重要的内源性氧化应激调节因子，通过与抗氧化反应元件（antioxiolant response element，ARE） 结合调节编码抗氧化蛋白的表达，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等，抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）的过度产生［4］。因此，调控Nrf2/HO-1 信号通路可能在调控缺血性脑卒中后细胞氧化与抗氧化平衡中发挥重要作用。

生姜是姜科植物姜的根茎，是一种广泛使用的食品成分，在传统医学中经常被用来治疗各种病症，包括感冒、恶心、哮喘、出血和肌肉疼痛［5-6］。此外，生姜还用于癌症、骨病、代谢功能障碍和血管疾病的治疗［7-8］。生姜的主要成分包括姜酚、姜酮、姜烯酚和姜酮酚等，由于上述成分的构象不同，可通过靶向不同的配体位点治疗年龄相关性神经系统疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病和中风等［8］。姜酮的化学名为4-（4-羟基-3-甲氧基丙基）-2-丁酮，是一种从生姜中提取的活性酚类化合物，是生姜的关键有效成分，具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种药理活性。目前关于姜酮能否改善缺血后神经功能损伤及相关分子机制尚不明确。本研究拟从细胞水平研究姜酮能否通过Nrf2/HO-1 信号通路减轻氧化应激损伤并抑制HT22 细胞凋亡，进而发挥神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞、主要试剂和仪器小鼠海马神经元HT22 细胞购自中国科学院细胞库。姜酮（纯度≥98%，CAS 122-48-5）购自上海融禾医药科技发展有限公司。无糖DMEM 培养基、高糖DMEM 培养基和胎牛血清均购自美国Gibco 公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 购自美国Sigma 公司，CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所，蛋白定量试剂盒和超敏ECL 化学发光试剂盒购自美国Thermo 公司，核蛋白抽提试剂盒购自美国Solarbio公司， Nrf2、 HO-1、 B 细胞淋巴瘤2 （B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）和GAPDH 抗体均购自美国Abcam 公司，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE） 预制胶和 SDSPAGE 上样缓冲液购自美国Invitrogen 公司，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗和辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自北京博奥森生物技术有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）和SOD 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Nrf2 抑制剂ML385 （CAS 846557-71-9） 购 自 美 国MedChemExpress 公司。

1.2 细胞培养和确定制备糖氧剥夺/复糖复氧（oxygen and glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）细胞模型最佳时间采用物理缺氧法处理生长状态良好的HT22 细胞建立体外OGD/R 模型，调节三气培养箱参数使培养环境中含有5% CO2、94.9% N2和0.1% O2，更换无糖DMEM 培养基实现OGD；随后恢复培养箱内环境为5% CO2和95%空气，更换为含糖DMEM 培养基实现复糖复氧。采用CCK-8 法检测OGD/R 不同时间点各组细胞活性，采用酶标仪在波长450 nm 处检测各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率，确定OGD/R 时间点，用于后续实验。细胞存活率=（实验组平均A 值-空白组A 值）/（对照组平均A 值-空白组A 值）×100%。

HT22 细胞OGD 0、2、4、6、8 和12 h 后，不同时间点细胞存活率见图1A，随着OGD 时间延长，细胞存活率逐渐降低，OGD 处理8 h 时细胞存活率已接近50%，故选用OGD 8 h 作为后续实验时间。随后，HT22 细胞经OGD 处理8 h 后分别设置复糖复氧0、2、4、6、8 和12 h 时间梯度，不同复糖复氧时间点细胞存活率见图1B，随着复糖复氧时间延长细胞存活率逐渐减低，8 h 时细胞存活率明显降低，因此选用OGD 8 h 后复糖复氧8 h 为制备OGD/R 模型最佳时间。

图1 CCK-8 法检测不同OGD/R 时间点HT22 细胞存活率Fig. 1 Survival rates of HT22 cells at different OGD/R time points detected by CCK-8 assay

1.3 姜酮保护OGD/R 损伤后HT22 细胞最适浓度确定将HT22 细胞分为对照组、OGD/R 组、OGD/R+1 μmol·L-1姜酮组、OGD/R+10 μmol·L-1姜酮组、OGD/R+100 μmol·L-1姜酮组和溶剂对照组（OGD/R+0.2% DMSO 组），OGD/R+不同剂量姜酮组HT22 细胞经不同浓度姜酮给药处理4 h 后予以OGD 8 h 和复糖复氧8 h 处理。采用CCK-8 法检测各组细胞存活率，确定姜酮最适浓度。细胞存活率计算方法见“1.2”。

1.4 细胞分组HT22细胞分为对照组、OGD/R 组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+ML385 组，其中OGD/R+姜酮组HT22 细胞经姜酮处理4 h 后予以OGD 8 h 和复糖复氧8 h 处理，OGD/R+姜酮+ML385 组HT22 细胞在姜酮处理前予以10 μmol·L-1ML385 预处理6 h。

1.5 CCK-8 法检测各组细胞存活率选取各组生长状态良好的HT22 细胞，0.125%胰酶消化、离心、重悬，细胞悬液按1×105cm-2的密度接种于96 孔细胞培养板中，每孔100 μL，设5 个复孔。37 ℃、5%CO2、95%空气和饱和湿度下无菌培养至细胞融合率达75%左右。按照实验分组对各组细胞分别进行OGD/R 及各种干预剂处理。每孔加入10 μL CCK-8 溶液，继续培养4 h，采用酶标仪在波长450 nm 处检测各孔A 值，计算各组细胞存活率，计算方法见“1.2”。

1.6 Western blotting 法检测各组细胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平HT22 细胞按1×105cm-2的密度接种于25 cm2细胞培养瓶，37 ℃、5%CO2、95%空气和饱和湿度下无菌培养至细胞融合率达75%左右。按照实验分组分别进行OGD/R 和各种干预剂等处理。吸取各组细胞培养上清备用，采用试剂盒提取各组细胞总蛋白和核蛋白，BCA 法测定各组上清液蛋白浓度，用裂解液调平后加入4×Loading buffer （体积比3∶1），充分混匀后95 ℃金属浴10 min。按照实验分组上样，每孔上样20 μL，使用SDS-PAGE 预制胶电泳分离不同相对分子质量蛋白质并转移至PVDF 膜上。 5% 脱脂奶粉室温封闭聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜2 h 后，加入一抗Nrf2 （1∶2 000）、HO-1 （1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）4 ℃孵育过夜。洗膜后加入二抗稀释液室温孵育2 h，滴加显色液后采用凝胶图像处理系统获取各目的蛋白条带及内参蛋白条带，采用Image J 软件分析各组细胞中目的蛋白条带和内参蛋白条带平均灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带平均灰度值/内参蛋白条带平均灰度值。

1.7 酶 联 免 疫 吸 附 试 验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法检测各组细胞培养上清中SOD 活性和MDA 水平将各组细胞培养上清液3 500 r·min-1低温离心10 min 后取上清，分别使用试剂盒检测SOD 活性和MDA 水平，具体操作严格按照说明书步骤进行。

1.8 统计学分析采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。所有实验结果均来自单独培养的3 个批次HT22 细胞，各组细胞存活率，各组细胞中Nrf2、HO-1、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平，各组细胞培养上清中SOD 活性和MDA 水平，均以表示，所有数据在进行统计分析前均进行正态性检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 姜酮保护OGD/R 损伤后HT22 细胞的最适浓度与对照组比较，OGD/R 组细胞存活率明显降低（P＜0.01）；与OGD/R 组比较， OGD/R+1 μmol·L-1姜酮组和OGD/R+0.2%DMSO 组细胞存活率差异无统计学意义（P＞0.05）；OGD/R+10 μmol·L-1姜酮组和OGD/R+100 μmol·L-1姜酮组细胞存活率明显升高（P＜0.05 或P＜0.01）。随着浓度升高，姜酮对OGD/R 处理后HT22 细胞保护作用逐渐增强，姜酮对OGD/R 处理后HT22 细胞保护最适浓度为100 μmol·L-1。见表1。

表1 不同剂量姜酮处理后各组HT22 细胞存活率Tab.1 Survival rates of HT22 cells in various groups after treated with different doses of gingerone（n=5,，η/%）

表1 不同剂量姜酮处理后各组HT22 细胞存活率Tab.1 Survival rates of HT22 cells in various groups after treated with different doses of gingerone（n=5,，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs OGD/R group.

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2.2 各组细胞存活率与对照组比较，OGD/R 组细胞存活率明显降低（P＜0.01）；与OGD/R 组比较，OGD/R+姜酮组细胞存活率明显升高（P＜0.01）；与OGD/R+姜酮组比较，OGD/R+姜酮+ML385 组HT22 细胞存活率明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 各组细胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups（n=5,，η/%）

表2 各组细胞存活率Tab.2 Survival rates of cells in various groups（n=5,，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.01 vs OGD/R group； #P＜0.01 vs OGD/R+gingerone group.

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2.3 各组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平与对照组比较，OGD/R 组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与OGD/R 组比较，OGD/R+姜酮组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；与OGD/R+姜酮组比较，OGD/R+姜酮+ML385 组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图2和表3。

表3 各组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in cells in various groups（n=5，）

表3 各组细胞中Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平Tab. 3 Expression levels of Nrf2 and HO-1 proteins in cells in various groups（n=5，）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs OGD/R group； #P＜0.01 vs OGD/R+gingerone group.

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图2 Western blotting 法检测各组细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达电泳图Fig. 2 Electrophoregram of expressions of Nrf2 and HO-1 proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.4 各组细胞中Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平与对照组比较，OGD/R 组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05），Bax 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与OGD/R 组比较，OGD/R+姜酮组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），Bax蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）；与OGD/R+姜酮组比较，OGD/R+姜酮组+ML385 组细胞中Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），Bax 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。见图3 和表4。

表4 各组细胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of Bax and Bcl-2 proteins in cells in various groups （n=5，）

表4 各组细胞中Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平Tab. 4 Expression levels of Bax and Bcl-2 proteins in cells in various groups （n=5，）

*P＜0.05， **P＜0.01 vs control group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs OGD/R group； #P＜0.01 vs OGD/R+gingerone group.

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图3 Western blotting 法检测各组细胞中Bcl-2 和Bax蛋白表达电泳图Fig. 3 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 and Bax proteins in cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 各组细胞培养上清中SOD 活性和MDA 水平与对照组比较，OGD/R 组细胞培养上清中SOD 活性明显降低（P＜0.01），MDA 水平明显升高（P＜0.01）；与OGD/R 组比较，OGD/R+姜酮组细胞培养上清中SOD 活性明显升高（P＜0.05）， MDA 水平明显降低（P＜0.01）； 与OGD/R+姜酮组比较，OGD/R+姜酮组+ML385 组细胞培养上清中SOD 水平明显降低（P＜0.01），MDA 水平明显升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组细胞培养上清中SOD 活性和MDA 水平Tab. 5 SOD activities and MDA levels in cell culture supernatant in various groups （n=5，）

表5 各组细胞培养上清中SOD 活性和MDA 水平Tab. 5 SOD activities and MDA levels in cell culture supernatant in various groups （n=5，）

*P＜0.01 vs control group； △P＜0.01 vs OGD/R group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs OGD/R+gingerone group.

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3 讨 论

脑血管急性闭塞后脑血流中断导致脑内葡萄糖和氧气供应减少，随即发生一系列急性代谢变化进而介导氧化应激损伤，后者进一步触发瀑布级联反应引起细胞死亡，包括细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、线粒体损伤、氧化应激、血小板激活/聚集、白细胞浸润、补体激活和血脑屏障破坏等多种复杂的病理生理过程［2］。其中梗死核心区血流灌注严重不足，神经元发生不可逆性迅速坏死。周围的缺血半暗带区灌注相对不足，神经元功能受到抑制并在一段时间内仍处于代谢活跃状态，此时脑组织功能损伤以凋亡为主且在一定时限内是可逆的，也是缺血性脑卒中后需要挽救的区域。半暗带脑组织若长时间得不到再灌注，梗死核心区可扩伸至缺血半暗带区，最终导致严重的神经元死亡和神经功能障碍［9］。由此可见，脑缺血的治疗过程是多重衔接和精密调控的过程，也是诸多调控因子参与调节的关键条件，因此脑缺血损伤后抑制神经元凋亡具有重要意义。体外细胞OGD/R 模型是模拟体内缺血性脑卒中较理想的模型。本研究采用HT22 细胞建立细胞OGD/R 模型，设置不同OGD/R 时间梯度，采用CCK-8 法检测各时间点细胞存活率，结果显示：OGD 8 h 和复糖复氧8 h 后HT22 细胞存活率低于正常50%，因此选用OGD 8 h 后复糖复氧8 h为制备OGD/R 模型最佳时间。

姜酮具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化等多种药理活性。研究［10］显示：姜酮通过上调结肠癌HCT116细胞促凋亡基因，促进细胞凋亡并抑制细胞增殖，进而发挥抗肿瘤作用。研究［11］显示：姜酮对心肌肥厚、高脂血症、左心室功能不全、三磷酸腺苷功能障碍和电解质紊乱均有预防作用，特别是在心肌梗死大鼠模型中，姜酮通过调控Bcl-2 家族基因，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶介导的死亡信号通路和Fas 受体，抑制异丙肾上腺素诱导的心肌梗死大鼠的氧化应激损伤，发挥抗炎和抗血栓作用。VAIBHAV 等［12］研究发现：姜酮是一种有效的抗氧化剂，通过抑制内在程序性细胞死亡（intrinsic programmed cell death，iPCD） 和氧化应激挽救缺血半暗带神经元。此外，有研究［13］显示：姜酮可能对帕金森等神经退行性疾病具有一定的防治作用，但其具体机制尚不明确。本研究结果显示：不同剂量姜酮对OGD/R 诱导的HT22 细胞损伤具有保护作用，且高剂量姜酮组保护作用更明显；OGD/R 诱导后的HT22 细胞予以高剂量姜酮处理，细胞培养上清中MDA 水平降低，SOD 活性明显升高，细胞中Bax 蛋白表达水平降低，而Bcl-2 蛋白表达水平升高，表明姜酮可改善OGD/R诱导的HT22 细胞氧化应激损伤，抑制细胞凋亡进而发挥细胞保护作用。

氧化应激损伤是CIRI 的重要机制之一。细胞中氧气和能量耗竭后可产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 过量产生可导致亚细胞结构如脂质膜、线粒体和DNA 的广泛破坏。研究［14-15］表明：Nrf2/ HO-1 信号通路在机体氧化应激和炎症反应过程中发挥着重要的调控作用。Nrf2是一种细胞中广泛存在的重要的转录因子，属于内源性抗氧化防御的重要调控因子，正常状态下与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECHassociated protein 1， Keap1）以Nrf2-Keap1 复合体形式存在而无活性，ROS 能够破坏该复合体结构并激活Nrf2，活化Nrf2 核转位并与特定基因启动子区域的ARE 结合，诱导抗氧化应激蛋白的表达，如HO-1、谷胱甘肽（glutathione，GSH） 和SOD等，从而降低氧化应激损伤［16-18］。HO-1 是血红素降解的限速酶，可以催化血红素基团降解产生游离铁、一氧化碳和胆绿素等抑制氧化应激和炎症反应［19］，也与细胞增殖有关联［20］。研究［4，21-22］表明：谷氨酸诱导的HT22 细胞可通过HO-1 的表达减轻氧化细胞毒性，发挥细胞保护作用。HO-1 在CIRI 和肺缺血再灌注损伤中发挥重要作用［23-24］。研究［25］显示：Nrf2 可减轻CIRI，且Nrf2 对脑缺血再灌注的保护作用也是通过调控下游抗氧化蛋白实现的。在脑组织损伤时，Nrf2 活化后能够进入细胞核内与ARE 序列进行识别并结合，上调HO-1 的表达，增强抗氧化应激能力。激活Nrf2/HO-1 信号通路可以产生抗氧化应激反应，继而对脑组织发挥保护效应［26］。动物实验［27］证实：脑梗死缺血区皮质中Nrf2 和下游蛋白HO-1 表达水平在缺血24 h 时明显增加，是影响脑梗死的关键因子。藏红花素或尼莫地平干预能够明显上调 Nrf2 和HO-1 表达并降低胞核NF-κB p65/胞浆NF-κB p65 比值，表明藏红花素对CIRI 大鼠氧化应激和炎症反应的抑制作用可能与激活Nrf2/HO-1 通路及抑制NF-κB p65 核转位有关［28］。研究［29］表明：Nrf2 对脑缺血的保护作用可通过调控下游相关蛋白实现，且过表达的Nrf2可通过干预抗氧化和抗凋亡相关蛋白对神经细胞发挥保护作用。本研究结果表明：给予Nrf2 抑制剂ML385 后，姜酮的抗氧化作用也被抑制，表明姜酮的抗氧化作用可能通过Nrf2 介导；给予姜酮干预后OGD/R 诱导的HT22 细胞死亡明显减少，给予Nrf2 抑制剂ML385 处理后可逆转姜酮的细胞保护作用，提示姜酮的细胞保护作用可能与Nrf2 有关；Western blotting 法检测细胞中HO-1 和核内Nrf2 的表达，结果显示：姜酮可明显上调Nrf2 的表达并促进其核转位，进而促进HO-1 的表达，发挥抗氧化应激作用。

综上所述，本研究通过HT22 细胞体外OGD/R 模型证实姜酮通过上调Nrf2 表达并促进其核转位，进而促进HO-1 的表达，减弱OGD/R 诱导的HT22 细胞氧化应激损伤并抑制细胞凋亡，发挥细胞保护作用。此外，姜酮激活Nrf2/HO-1 通路是否在CIRI 模型小鼠中仍具有抗氧化应激损伤及抑制细胞凋亡作用仍需进一步研究证实。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

侯玮琛参与实验设计和论文撰写，张桂美参与数据收集整理和统计图绘制，张舒石参与论文修改和论文审阅。