益经汤对环磷酰胺所致卵巢早衰小鼠的治疗作用研究

牛逸琳，陈烁，陈雨诗，何冬梅，尹永芹

（1.广东药科大学，广东 广州 510006；2.惠州市中医医院，广东 惠州 516001）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指女性40 岁前由于性激素水平紊乱而导致的卵巢功能障碍，临床表现为月经稀发、闭经及潮热、焦虑、抑郁等围绝经期症状，常伴有促卵泡激素（follicle stimulating hormone,FSH）和促黄体生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素（estradiol, E2）水平降低[1]，是早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）的终末阶段[2]。POF 的发病机制复杂，中医认为其与肾虚、冲任虚衰有关，研究表明自身免疫性因素、遗传、代谢、药物和感染等均可导致本病发生[3]。现代医学主要以激素代替疗法进行治疗，虽可改善患者临床表现，但停药后易复发且可能提高乳腺癌的发生率[4]。

益经汤出自《傅青主女科》，其药物包括熟地黄、白术、山药、当归、白芍、酸枣仁、牡丹皮、北沙参、柴胡、杜仲、人参，主要治疗“年未老经水断”。傅氏认为：“经原非血也……出自肾中”，“女子年未七七而经水先断者，人以为血枯经闭也，谁知是心肝脾之气郁乎！”方中以熟地黄滋补肾阴，杜仲温补肝肾，白术、山药补脾益气，人参大补元气，当归、白芍养肝活血，酸枣仁养心安神，柴胡疏肝解郁，北沙参养阴生津，牡丹皮清热凉血。余卉娇[5]使用益经汤对POF 患者进行治疗，显著改善月经周期，降低血清中FSH 及E2水平。陶莉莉等[6]发现卵泡细胞的过快凋亡导致卵巢功能减退，加减益经汤可增加卵巢Bcl-2 表达，减少Bax 表达，抑制卵泡细胞凋亡。万云慧[7]发现使用加减益经汤治疗后的POF 患者血清FSH、LH 水平明显降低，窦状卵泡数量增加。益经汤在调经促孕方面疗效较好，临床常用其加减方治疗卵巢早衰等妇科疾病，但其发挥作用的机制尚不清楚。课题组前期通过网络药理学研究益经汤对POF 的作用通路主要为PI3K-AKT（PI3K-AKT signaling pathway）、癌症中的蛋白多糖（proteoglycans in cancer）等。PI3K-AKT 信号通路参与细胞活化凋亡，调控卵泡的发育和闭锁，同时FOXO3A 作为该通路下游转录因子之一，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥重要作用。因此本文通过观察益经汤对POF 小鼠治疗作用及PI3K/AKT/FOXO3A 的影响，探讨其治疗POF的作用机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠40 只，5～6 周龄，雌性，体质量15～25 g，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2022-0002。动物实验操作经广东药科大学实验动物伦理委员会批准（gdpu‐lacspf2022034）。

1.2 主要试剂耗材和仪器

注射用环磷酰胺（H2124176，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；戊酸雌二醇片（补佳乐，H20160679，拜尔医药保健有限公司广州分公司）；苏木素伊红（HE）染液（G1120，北京索莱宝科技有限公司）；小鼠雌E2、FSH、LH、抗缪勒氏管激素（AMH）、孕酮（PROG）酶联反应吸附试验ELISA试剂盒（MM-0566M1、MM-0555M1、MM-44039M1、MM-44202M1、MM-0568M1，广州研赛生物制品有限公司）；PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白单克隆抗体（AF6241、AF6261、AF6020，Affinity Biosciences）。氯化钠注射液（H22070710，广东科伦药业有限公司）；异氟烷（H20020267，鲁南贝特制药有限公司）；4%多聚甲醛通用型组织固定液（22291398，广州硕谱生物科技有限公司）。

IMS-70 型全自动雪花制冰机（常熟市雪科电器有限公司）；BX51 型光学显微镜（日本Olympus 公司）；−80 ℃超低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）；FA2104型电子天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）；RM2016 病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；H1650-W 台式微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；DK-8D 型三孔电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；Spectra MAX Plus384 型酶标仪（美谷分子仪器有限公司）。

2 方法

2.1 益经汤的制备

益经汤使用处方颗粒，由海东市平安正阳互联网中医医院有限公司提供，全方与益经汤原方一致。生药由熟地黄30 g、麸炒白术30 g、北柴胡3 g、盐杜仲3 g、酒当归15 g、麸炒山药15 g、人参6 g、牡丹皮6 g、北沙参9 g、酸枣仁9 g、炒白芍9 g 组成，生药量135 g，颗粒剂1剂36 g，1 g相当于生药量3.75 g。将益经汤颗粒加蒸馏水调配成质量浓度为0.32 g/mL和0.96 g/mL的药液，低温储藏备用。

2.2 POF模型构建及分组给药

参考文献[8]方法建立卵巢早衰模型，造模小鼠腹腔注射CTX 溶液。因CTX 具有自限性，采用首日腹腔注射60 mg/kg，2～15 日腹腔注射8 mg/kg，建立POF 小鼠模型，注射体积为10 mL/kg。空白组腹腔注射与模型组等量的生理盐水，1 次/d，共15 d。注射结束24 h 后每日进行阴道涂片，移液枪吸取生理盐水冲洗小鼠阴道2～3 次后进行涂片，自然风干进行HE 染色。观察小鼠阴道涂片，若出现动情周期紊乱则视为造模成功[9]。

选取动情周期规律的小鼠，随机抽取6 只作为空白组，其余小鼠造模成功后，采用随机数字表法将小鼠随机均分为4 组，分别为模型组、阳性对照组、益经汤低剂量组、益经汤高剂量组，每组6 只。根据体表面积比换算，以小鼠与人体药物等效剂量倍数为12.33，分别计算各组给药剂量。各组给药方法如下：益经汤低、高剂量组分别以益经汤颗粒6.34、19.02 g/（kg·d）进行灌胃；阳性对照组以戊酸雌二醇片0.18 mg/（kg·d）灌胃；空白组和模型组给予蒸馏水灌胃。各组灌胃体积均为20 mL/kg，1 次/d，共30 d。

2.3 取材

益经汤干预30 d 后，各组小鼠均需禁食不禁水12 h，称取小鼠体质量。用异氟烷进行麻醉，眼球取血法取血放置EP 管中，静置分层后，在4 ℃下以3 000 r/min 离心10 min，提取血清置于−20 ℃冰箱保存备用。分别摘取双侧卵巢、肾脏及子宫，去除附着在表面的筋膜及脂肪等，精密称重，部分组织放入4%（φ）多聚甲醛固定液中；其余组织−80 ℃冰箱冷冻保存。动物尸体进行无害化处理。

2.4 检测体质量及脏器指数变化

实验期间，每周观察小鼠毛发、精神状态及活动情况。小鼠造模及给药期间每隔一天称质量，实验开始及实验结束当天称体质量，取各脏器称重并计算脏器指数。根据各脏器湿质量，卵巢、子宫指数计算公式分别为：卵巢指数＝卵巢湿质量（g）／体质量（g）×100%；子宫指数＝子宫湿质量（g）／体质量（g）×100%。

2.5 观察小鼠动情周期

在造模及给药期间每日进行阴道脱落细胞检查，移液枪吸取生理盐水冲洗小鼠阴道2～3 次，将脱落细胞均匀涂抹在载玻片上，自然风干后，95%乙醇固定3 min，苏木精染液染色5 min，冲洗后盐酸乙醇分色数秒，自来水冲洗反蓝5 min，伊红染色2 min，冲洗后干燥，封片判断动情周期，连续45 d。正常小鼠动情周期多为4～5 d，其余则视为动情周期紊乱。各组小鼠动情周期紊乱率=动情周期紊乱小鼠只数/各组小鼠总只数×100%。

2.6 HE染色法观察小鼠卵巢、子宫组织变化

卵巢、子宫组织放置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后，经过石蜡包埋后，切片，脱蜡，苏木素染液浸泡10 min，纯水清洗15 s，分化液5 s，纯水清洗15 s 后放入纯水浸泡5 min 返蓝，伊红染液浸泡3 min 后脱水，中性树胶封片，光学显微镜下观察卵巢、子宫的组织学变化。

2.7 ELISA 法检测血清E2、FSH、LH、AMH、PROG表达

通过ELISA 法检测各组小鼠血清E2、FSH、LH、AMH、PROG 水平，根据试剂盒说明书操作，使用酶标仪在450 nm 波长下检测吸光度（A），建立标准曲线，按曲线方程计算E2、FSH、LH、AMH、PROG浓度。

2.8 卵巢中PI3K、AKT、FOXO3A蛋白表达水平

取卵巢组织经梯度乙醇脱水固定、包埋切片等处理之后，采用免疫组织化学检测蛋白表达水平：经过脱蜡，采用内源性过氧化物酶阻断剂进行阻断，抗原修复，洗涤后加入封闭液，室温60 min；加入一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后加入相应二抗37 ℃孵育30 min，洗涤后加入DAB 显色剂显色，苏木素复染30 s 后封片，400 倍的显微镜下观察拍照。用Image Pro Plus软件分析。

2.9 统计学分析

使用SPSS 17.0 统计软件进行统计分析，实验数据以表示，使用t检验，采用单因素方差分析进行组间分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 动情周期变化

通过对阴道脱落细胞涂片分析小鼠造模情况。正常小鼠动情周期多为4～5 d，分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。若小鼠的动情周期表现为混乱无序、持续时间超过6 d，或长期停滞在某个时期，则认为小鼠出现动情周期紊乱，代表POF 模型构建成功，见图1。实验结束时，空白组小鼠表现出规律的动情周期；模型组有83.33%的小鼠动情周期紊乱，益经汤低、高剂量组分别有33.33% 和16.67%的小鼠动情周期紊乱，提示益经汤可以改善由CTX造成的动情周期紊乱。

3.2 益经汤对各组小鼠体质量以及卵巢、子宫指数的影响

体质量变化情况见表1。造模结束后，相较于空白组，模型组小鼠体质量显著降低（P＜0.05）；相较于模型组，阳性组和益经汤高剂量组小鼠体质量明显升高（P＜0.05）。益经汤低剂量组体质量也呈升高趋势。

表1 各组小鼠体质量变化情况Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

表1 各组小鼠体质量变化情况Table 1 Changes in body weight of mice in each group(,n=6)m/g

与空白组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05。

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卵巢指数如表2所示，与空白组比较，模型组的卵巢指数显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，益经汤高剂量组卵巢指数显著性升高（P＜0.05），其余给药组也呈现升高趋势。

表2 各组小鼠卵巢、子宫指数比较Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

表2 各组小鼠卵巢、子宫指数比较Table 2 Comparison of ovarian and uterine indices among different groups of mice(,n=6)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

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子宫指数如表2所示，相较于空白组，模型组的子宫指数显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组和益经汤高剂量组子宫指数均显著性升高，以阳性对照组最为显著（P＜0.01）。

3.3 卵巢、子宫组织形态变化

HE 染色结果显示，空白组小鼠卵巢形状完整，可见较多不同发育阶段卵泡，细胞间质及血管纤维较少。与空白组相比，模型组卵巢体积减小，可见少量次级卵泡，闭锁卵泡增多，卵巢基质层结构紊乱，出现较大细胞间质和纤维化现象；与模型组相比，各给药组卵巢体积增大，次级卵泡和初级卵泡数量较多，伴随少量窦状卵泡，卵巢基质层结构有所改善，细胞间质和纤维化现象减少，见图2。

图2 益经汤对各组小鼠卵巢组织病理形态的影响(HE,100×)Figure 2 Effect of Yijing decoction on the pathological morphology of ovarian tissue in mice of different groups(HE,100×)

空白组小鼠子宫结构完整，子宫腺上皮细胞形态正常，腺体分布密集，子宫肌层纤维排列紧密。与空白组比较，模型组小鼠子宫腺体明显减少，结构不完整，腺体稀疏且排列不整齐；与模型组比较，各给药组子宫内膜增厚，子宫腺上皮细胞排列较为整齐，腺体数量增加，见图3。

3.4 血清性激素水平的影响

与空白组相比，模型组小鼠血清E2、AMH、PROG 水平显著降低，FSH、LH 水平显著性升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，阳性对照组和益经汤低、高剂量组血清E2、AMH、PROG水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），FSH、LH 水平显著下降（P＜0.01）。结果见表3。

表3 益经汤对各组小鼠血清性激素水平的影响Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

表3 益经汤对各组小鼠血清性激素水平的影响Table 3 Effect of Yijing decoction on serum sex hormone concentration in mice of different groups(,n=6)

与空白组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.5 益经汤对小鼠卵巢PI3K/AKT/ FOXO3A 通路蛋白表达水平的影响

通过免疫组化（IHC）对小鼠卵巢PI3K、AKT 和FOXO3A 表达进行检测，并对吸光度（A）进行分析。与空白组相比，PI3K、AKT、FOXO3A 3 种蛋白在模型组表达皆显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组及益经汤低、高剂量组中蛋白表达均显著降低（P＜0.01）。显示阳性药及益经汤对PI3K、AKT、FOXO3A 蛋白表达有抑制作用，结果见图4－5。

图4 各组小鼠卵巢PI3K、AKT、FOXO3A表达比较Figure 4 Comparison of ovarian PI3K,AKT,and FOXO3A expression in mice of different groups(,n=6)

图5 IHC检测卵巢PI3K、AKT、FOXO3A的表达Figure 5 IHC detection of ovarian PI3K，AKT，FOXO3A expression（200×）

4 讨论

卵巢早衰发病机制复杂，临床表现为持续性闭经、不孕和更年期综合征等。随着社会压力不断增大，卵巢早衰趋于年轻化，对于心血管系统、生殖系统、神经系统等均造成不同程度的危害。目前的临床检测手段主要包括内分泌激素测定、基础卵巢体积、窦状卵泡计数等[10]，治疗则主要有雌孕激素补充治疗、干细胞治疗、卵巢移植、促排卵疗法等。西医治疗方法产生的副作用不可忽视，中医整体观念、辨证论治的思想则具有明显优势。POF 临床症状在中医归为月经过少、闭经、血枯、不孕症等范围，经典方益经汤重在心肝脾肾四经同治，强调“补以通之、散以开之”[11]，正如《傅青主女科》中所言：“散心肝脾之郁，而大补其肾水，仍大补其心肝脾之气，则精溢而经水自通矣”，临床已证实其功效。

李丽美等[12]通过构建卵巢储备功能下降（DOR）大鼠模型研究加减益经汤对其影响，发现加减益经汤可以改善DOR 模型大鼠的性激素水平以及卵巢组织病理形态。DOR 会使血清中E2的水平下降，FSH、LH 水平明显升高。E2主要由卵泡颗粒细胞分泌，可维持正常生殖功能，对于PROG合成亦存在促进作用，协同维持妊娠过程[13]；AMH 是糖蛋白家族中的一员，主要由卵巢窦前卵泡和小窦卵泡细胞分泌，通过调控起始和循环募集达到对卵巢储备的影响，同时抑制卵泡的生长，与卵巢功能密切相关[14]。在卵泡生长发育过程中，LH可刺激卵泡内膜分泌睾酮，由FSH 刺激颗粒细胞对睾酮进行转化为E2，二者协同作用可有效促进E2、PROG 的合成与释放，同时受到E2、PROG 的负反馈调节[15]，反映卵巢功能。CTX 作为一种化疗药物，会使处于生殖期年轻患者的卵巢严重损伤，会导致卵巢颗粒细胞凋亡和大量卵泡停滞发育等，引起闭经、不育和POF。本实验以CTX 所致POF 模型小鼠为对象，研究益经汤对其治疗作用。实验表明，小鼠造模后出现动情周期紊乱，卵巢及子宫指数明显下降，组织形态也出现对应的变化，血清E2、AMH、PROG 水平表达降低，LH、FSH 水平表达上升，反映实验造模成功。经药物干预，与模型组相比，小鼠毛发光亮浓密，体质量有所上升，食欲和精神状态均有改善；在卵巢组织切片中观察到卵巢体积增大，次级和初级卵泡数量增多，细胞间质和纤维化现象减少，小鼠卵泡发育情况有所改善；子宫组织切片中，观察到子宫内膜增厚，子宫腺上皮细胞排列变得整齐，腺体数量有所增加；血清激素水平结果显示，阳性对照组和益经汤高剂量组血清E2、AMH、PROG 水平均升高，FSH、LH 水平显著下降（P＜0.05，P＜0.01）。通过益经汤给药治疗，以上病理指标均有不同程度改善，结果表明益经汤在生活行为、卵泡发育和激素水平层面对CTX 诱导的POF 小鼠卵巢具有保护作用，根据子宫相关病理数据，提示益经汤在保护卵巢时可能对子宫也有一定影响。

PI3K/AKT 信号通路是调节自噬的经典传导通路，可以调控卵巢颗粒细胞的增殖与分化、卵母细胞的减数分裂等，与卵泡发育和闭锁有着密切的关系。FOXO3A是PI3K/AKT 通路下游重要转录因子之一，也参与了细胞的增殖、分化、凋亡以及衰老等。目前认为卵巢中多数原始卵泡都处于静息休眠状态，每个周期中只有极少数会被激活进入生长卵泡池，一旦过度激活进入生长卵泡池，会有大量生长卵泡发生异常闭锁，导致DOR 的发生[16]，所以维持卵泡状态的动态平衡尤为重要。本实验结果显示，模型组小鼠卵巢AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表达显著性升高，说明在CTX 作用下该通路被过度激活，卵泡发生异常闭锁，导致卵巢早衰的发生。经过治疗后，给药组AKT、PI3K、FOXO3A蛋白表达较模型组显著降低，差异具有统计学意义。

综上所述，益经汤能够有效改善POF 小鼠动情周期、卵巢与子宫指数和组织形态学变化，改善卵巢和子宫的功能，其机制可能与提高血清E2、AMH、PROG 和降低FSH、LH 的表达以及调控PI3K/AKT/FOXO3A 通路相关蛋白表达水平有关，达到维持正常卵巢储备水平、预防卵巢早衰的作用。益经汤在治疗卵巢方面的研究较多，应用于子宫较少，有待进一步探索。