南瓜子饮片标准汤剂的制备及质量标准的研究

唐双燕，魏家保，蔡素琴，詹智洪，黄凯伟，赵伟志，张辉

（1.华润三九现代中药制药有限公司，广东 惠州 516000；2.华润三九医药股份有限公司，广东 深圳 518000）

南瓜子为葫芦科南瓜属植物南瓜Cucurbita moschata（Duch.）Poiret.的种子，具有通便驱虫之功效，可用于大便秘结、肠道丝虫、蛲虫、蛔虫、绦虫等。南瓜子中富含氨基酸、蛋白质、多糖、多不饱和脂肪酸和矿物质等[1−4]，其中氨基酸是其最主要的活性成分。现代药理研究也表明南瓜子中氨基酸类成分可以改善脑血管的流通，调节脑神经，还可以调节血压，维持人体正常的代谢需要，合成人体内的免疫球蛋白，从而起到保护机体、提高人体免疫力的作用[5−10]。因此，南瓜子中的氨基酸成分是其发挥良好的药理作用的关键所在[11]。查阅目前南瓜子药材的质量标准收载情况，如《中华人民共和国卫生部药品标准（维吾尔药分册）》、《甘肃省中药材标准（2009年版）》、《山东省中药材标准（2002 年版）》[12−14]等仅收载南瓜子性状、显微等项，缺少系统的质量控制方法，且化学成分的研究主要集中在南瓜子氨基酸的测定方面[15−20]，所建立的质量标准相对单一，并不能准确反映中药材和中药制剂的质量。因此有必要对南瓜子的质量标准展开深入的研究，为南瓜子的应用以及配方颗粒的研究提供依据和参考。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、分离、浓缩、干燥、制粒而成的颗粒，在中医药理论指导下，按照中医临床处方配方后供患者冲服使用，其临床疗效应当和相应的饮片保持一致。为加强中药配方颗粒质量管理，国家药品监督管理局2021年1 月公布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[21−24]，明确了标准汤剂为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的物质基准。中药标准汤剂为遵循中医药理论，由不少于15批有代表性的原料，经炮制加工后，分别按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制得或经适宜方法干燥制得。本研究以传统汤剂的煎煮方法为基准，建立以出膏率、指标成分苯丙氨酸的质量分数及转移率、薄层色谱以及特征图谱为评价指标的质量标准，为南瓜子配方颗粒标准的制定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪：Thermo Ultimate 3000 色谱系统，包括LPG-3400SDN 四元梯度输液泵、WPS-3000SL 自动进样器、TCC-3000SD 色谱柱温箱、DAD-3000二极管阵列紫外检测器、Chromeleon 7色谱管理系统（赛默飞世尔科技有限公司）；ME36S 百万分之一分析天平［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；XSE205十万分之一分析天平［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；SK5200H 超声波仪（上海科导超声仪器有限公司）；500 W 自动型砂锅（深圳市一枚王电子商务有限公司）；HH-8恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）；DHG 9240AGZ 热风循环烘箱［中仪国科（北京）科技有限公司］；YRE-501旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任有限公司）；GOLD-sim冷冻干燥机（青岛永合创信电子科技有限公司）；DFY-600C 中药粉碎机（温岭市林大机械有限公司）。

1.2 试剂、试药

南瓜子对照药材（批号：330023-202301）购于上海鸿永生物科技有限公司；苯丙氨酸（批号：140676-201706，质量分数100%）、酪氨酸（批号：140609-202215，质量分数100%）、丙氨酸（批号：140680-202207，质量分数99.9%）均购于中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，水为超纯水；正丁醇、冰乙酸、乙醇、茚三酮、甲醇等其他试剂均为分析纯。

1.3 样品

15批南瓜子分别来源于安徽亳州、安徽阜阳、山东潍坊、山东济南和河南商丘，并经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为葫芦科植物南瓜Cucurbita moschata（Duch.）Poiret.的干燥成熟种子。详细信息见表1。

表1 15批南瓜子信息表Table 1 The information of 15 batches of pumpkin seeds

2 方法与结果

2.1 标准汤剂的制备

依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[24]和《医疗机构中药煎药室管理规范》[25]中相关要求制备南瓜子饮片标准汤剂。

取南瓜子药材，除去杂质，取约100 g，捣碎（破碎度不低于90%），置砂锅中，加入8 倍水浸泡30 min，先武火煮沸，再文火煎煮30 min，200目滤布趁热滤过；药渣再加6 倍水，武火煮沸后，再文火煎煮25 min，200 目滤布趁热滤过，合并滤液，滤液减压（65 ℃）浓缩至料液比接近1∶（3～5）浓浸膏，置于冷冻干燥机中干燥，即得南瓜子饮片标准汤剂。15批南瓜子饮片均按以上方法制备成标准汤剂。

2.2 出膏率的测定

将15批饮片制备成标准汤剂，每批饮片平行制备2 份。测定各批次标准汤剂的出膏率，结果见表2。

表2 15批南瓜子饮片标准汤剂出膏率及范围Table 2 Extraction rate and range of 15 batches of pumpkin seed standard decoction

2.3 TLC的鉴别

南瓜子饮片标准汤剂中水溶性成分以氨基酸类成分居多，结合南瓜子药材的化学成分种类，对制备的15批南瓜子饮片标准汤剂建立薄层鉴别方法。

取南瓜子饮片标准汤剂0.3 g，研细，加稀乙醇20 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加稀乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丙氨酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液，作为对照品溶液。按照薄层色谱法（《中华人民共和国药典》2020年版“通则0502”）试验，分别吸取上述2 种溶液各2µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇-甲醇-冰乙酸-水（15∶4∶5∶5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%茚三酮乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置白光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。15 批南瓜子饮片标准汤剂薄层色谱图信息全面，斑点清晰。各批次均能达到良好的分离效果，见图1。

图1 南瓜子15批饮片标准汤剂的TLC色谱图Figure 1 TLC chromatogram of 15 batches of standard decoction of pumpkin seeds

2.4 质量分数测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters Atlantis T3，4.6 mm×250 mm，5 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱（0～10 min，0%A→4%A；10～35 min，4%A→7%A；35～42 min，7%A→22%A；42～50 min，22%A→36%A）；检测波长为210 nm；柱温为25 ℃；流速为1.0 mL/min；理论塔板数按苯丙氨酸峰计算应不低于3 000。

2.4.2 对照品溶液的制备 取苯丙氨酸对照品适量，精密称定，加10%（体积分数，下同）甲醇制成每1 mL含50 μg的对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备

2.4.3.1 饮片标准汤剂供试品溶液的制备取南瓜子饮片标准汤剂约0.5 g，精密称定，加水20 mL 溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3.2 饮片供试品溶液的制备取南瓜子饮片（过3 号筛）约2.0 g，精密称定，加水50 mL，水浴加热回流30 min，取出，放冷，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 线性关系的考察 取苯丙氨酸对照品适量，精密称定，加10%（体积分数，下同）甲醇制成质量浓度为0.42 mg/mL 的对照品储备液。将储备液逐级稀释为每1 mL 含苯丙氨酸分别为12.5、50、100.0、200.0、400.0 μg 的对照品溶液，精密吸取上述5 种不同质量浓度的对照品溶液各10µL 注入高效液相色谱仪，按“2.4.1”项下条件分别进样测定，以对照品的进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标绘制标准曲线，得苯丙氨酸回归方程为Y=32.617X+2.227（r=0.999），在12.5～400 µg/mL 范围内线性关系良好。

2.4.4.2 精密度试验 取南瓜子饮片标准汤剂供试品溶液（S1），连续进样6 次，按“2.4.1”项下方法测定。丙苯氨酸色谱峰峰面积的RSD%值为0.7%，表明仪器精密度良好。

2.4.4.3 重复性试验 取南瓜子饮片标准汤剂供试品溶液（S1）6份，按“2.4.3.1”项下方法制备供试品溶液，计算质量分数。结果显示，苯丙氨酸峰面积的平均质量分数RSD值为0.5%，表明方法重复性良好。

2.4.4.4 稳定性试验 取南瓜子饮片标准汤剂供试品溶液（S1），按“2.4.3.1 ”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、4、8、12、16、24 h 按照“2.4.1”项下方法进行测定。24 h内苯丙氨酸峰峰面积的RSD值为0.8%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4.5 加样回收率试验 分别精密称取苯丙氨酸对照品1.123 mg、2.181 mg、3.362 mg置100 mL量瓶中，加水制成每1 mL 含苯丙氨酸0.011 2、0.021 8、0.033 6 mg的对照品溶液，备用。

取已知指标成分质量分数的南瓜子饮片标准汤剂（S1）0.25 g，共9 份，置具塞锥形瓶中，分3 组（低、中、高浓度）精密加入20 mL上述对照品溶液各3 份，按“2.4.3.1”项下方法制备9 份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，计算平均加样回收率，结果苯丙氨酸平均回收率分别为94.4%、97.9%、100.5%，RSD值为3.6%，具体信息见表3。

表3 南瓜子饮片标准汤剂中苯丙氨酸加样回收率试验结果Table 3 Results of recovery of phenylalanine in standard decoction of pumpkin seeds（n=3）

2.4.4.6 南瓜子饮片标准汤剂质量分数的测定及转移率的计算 取15 批南瓜子饮片及所制备的饮片标准汤剂，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，计算苯丙氨酸的质量分数。根据公式计算：转移率=南瓜子饮片标准汤剂中苯丙氨酸质量分数×出膏率/南瓜子饮片中苯丙氨酸质量分数×100%。结果表明，15 批南瓜子饮片标准汤剂中苯丙氨酸平均质量分数为1.43 mg/g，苯丙氨酸质量分数范围为0.56 ～1.99 mg/g，苯丙氨酸的转移率均值为69.7%，苯丙氨酸转移率范围为42.7%～86.1%，结果见表4。

表4 南瓜子饮片标准汤剂中苯丙氨酸的质量分数及转移率Table 4 Content and transfer rate of phenylalanine in stan‐dard decoction of pumpkin seed slices

2.5 特征图谱的建立

2.5.1 色谱条件 同“2.4.1”项下。

2.5.2 对照品溶液的制备 分别取苯丙氨酸、酪氨酸对照品适量，精密称定，加10%甲醇分别制成每1 mL含苯丙氨酸、酪氨酸50 μg的对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 同“2.4.3”项下。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 专属性试验 分别精密吸取阴性对照溶液（水）、“2.5.2 ”项下对照品溶液、供试品溶液各10 μL，分别注入高效液相色谱仪，按“2.5.1”项下方法测定，结果表明阴性对照无干扰，方法专属性良好。

2.5.4.2 精密度试验 取南瓜子饮片标准汤剂（S1）供试品溶液，连续进样6次测定，结果各特征峰的相对保留时间RSD 值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.5.4.3 重复性试验 取南瓜子饮片标准汤剂（S1），平行制备6 份供试品溶液进样测定，结果各特征峰的相对保留时间RSD 值均小于2.0%，表明方法重复性良好。

2.5.4.4 稳定性试验 取南瓜子饮片标准汤剂供试品溶液（S1），于配制后第0、4、8、12、16、24小时进样测定，记录各共有峰的保留时间。结果表明各共有峰与参照峰的相对保留时间RSD值均小于2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 共有峰的标定及共有模式的建立 取15 批南瓜子饮片及饮片标准汤剂，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，将实验数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”，将各色谱峰匹配，建立的特征图谱呈现13个共有特征峰，15批样品特征图谱相似度均大于0.9，13 个峰占色谱峰总面积的95%以上，提示该方法可用于南瓜子药材质量的整体评价。通过对照品指认了2 个特征峰，其中峰3 为酪氨酸，峰7为苯丙氨酸。将苯丙氨酸峰标为S峰，计算特征峰峰1、2、4、5、6、8、9、10、11、12、13 与S 峰的相对保留时间，分别为0.27（峰1）、0.37（峰2）、0.53（峰4）、0.60（峰5）、0.71（峰6）、1.10（峰8）、1.28（峰9）、1.40（峰10）、1.85（峰11）、2.23（峰12）、2.32（峰13）。见图3－5、表5。

图3 南瓜子饮片标准汤剂的HPLC色谱图Figure 3 HPLC chromatograms of pumpkin seed slices stan‐dard decoc

图4 15批南瓜子饮片标准汤剂的HPLC叠加图谱Figure 4 HPLC overlay chromatograms of 15 batches of pumpkin seed slices standard decoction

图5 15批南瓜子饮片的HPLC叠加图谱Figure 5 HPLC overlay chromatograms of 15 batches of pumpkin seeds decoction pieces

表5 15 批南瓜子饮片及饮片标准汤剂相似度Table 5 Similarity of 15 batches of pumpkin seed slices and standard decoction

3 讨论

3.1 色谱条件及供试品溶液制备方法的选择

本研究考察了不同品牌的色谱柱、不同有机相体系（甲醇、乙腈）、不同流动相（0.1%磷酸、0.1%醋酸、0.1%甲酸、水）、不同柱温（23、25、30 ℃）、不同流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）、不同品牌仪器（Waters e2695、Agilent 1260 和UltiMate 3000）的分离效果，结果特征图谱以检测波长210 nm、甲醇-水为流动相；柱温为25 ℃；流速为1.0 mL/min 时分离效果较好。同时考察了不同提取溶剂（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、乙醇）的提取效果，结果以水提取时效果最好。

3.2 南瓜子饮片标准汤剂的质量控制

3.2.1 原料的选择 本研究基于历史古籍的本草考证及产地实际考察，确定了在古籍中记载的基原性状判断与《卫生部药品标准维药分册》[12]中的基原相同，为葫芦科植物南瓜的干燥成熟种子。15 批南瓜子药材来自不同的主产区，所选样品在产地、质量水平等方面均具有代表性。

3.2.2 出膏率的研究 根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，按照中药调剂“逢壳必捣，逢籽必破”等传统经验对饮片进行预处理[24]，并对南瓜子的破碎粒度进行考察。最终选择破壳率应不低于90%。本研究结合标准汤剂的制备工艺要求，加水量以浸过药面2～5 cm 为宜，对其加水量及煎煮时间进行考察，研究显示加水量对出膏率影响不大，随着煎煮时间的增加，出膏率会有所增减，但相差不大，因此出于节约资源、同时为后续浓缩工序节约时间的考虑，确定标准汤剂制备工艺为一煎加8 倍水，煎煮30 min；二煎加6 倍水，煎煮25 min[19−20]。15 批南瓜子饮片制备成南瓜子饮片标准汤剂的出膏率在10.4%～18.3%之间，各批次间出膏率差异不大，说明标准汤剂制备工艺稳定可行。

3.2.3 质量分数测定的研究 建立氨基酸质量分数测定方法时对供试品制备方法进行了考察，并开展了方法学的验证（专属性、线性、精密度、重复性、稳定性），结果表明方法专属性强、重复性好，符合质量分数测定的要求。通过测定转移率及出膏率重点考察标准汤剂制备工艺的稳定性，通过质量分数测定考察不同批次标准汤剂质量的均一性。结果南瓜子15 批次标准汤剂中苯丙氨酸质量分数为0.56 ～1.99 mg/g，转移率范围为42.7%～86.1%，表明各批次南瓜子中苯丙氨酸质量分数稍有差异，应与产地、批次差异性有关。

3.2.4 定性鉴别的研究 根据文献报道，南瓜子的主要化学成分为氨基酸、脂肪酸等[17−19]。由于南瓜子饮片标准汤剂为经水煮后提取的物质，应综合考虑化学成分的水溶性特点及化学成分的质量分数，质量分数较低或脂溶性的物质可能无法在水溶后进行呈现。在南瓜子的以上成分中，氨基酸成分质量分数较高且水溶性较好，故将其作为南瓜子饮片标准汤剂特征图谱的主要化学成分。

在特征图谱研究中，根据多批南瓜子饮片及饮片标准汤剂的测定结果，确立了南瓜子饮片及饮片标准汤剂供试品色谱的13 个特征峰，并指认苯丙氨酸与酪氨酸2 种成分。经“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）软件”计算，各批次南瓜子饮片以及饮片标准汤剂特征图谱的相似度均大于0.9，说明南瓜子饮片标准汤剂的化学组分共性较好，方法学考察符合要求，本方法稳定可行、重复性良好。

4 结语

本研究收集并制备了15 批不同产地的南瓜子饮片标准汤剂，建立以丙氨酸为对照的南瓜子氨基酸成分TLC 鉴别法；采用苯丙氨酸为指标成分进行质量分数测定，计算了15 批样品的转移率和出膏率；同时建立南瓜子饮片标准汤剂的特征图谱检测方法，利用对照品指认出其中2 个特征峰。本研究所建立的方法具有良好的可行性与准确性，能较全面反映南瓜子饮片标准汤剂的内在质量，可为南瓜子饮片质量控制提供参考，为南瓜子饮片标准汤剂的制备及质量研究提供基础，同时为南瓜子饮片新剂型的开发、使用剂量统一以及质量监测奠定基础。