基于多指标综合评分法优化升阳化浊降糖方的提取工艺
2024-02-06陈雪婷张建军徐文杰冯健英李智勇
陈雪婷，张建军，徐文杰，冯健英，李智勇
［广东省第二中医院（广东省中医药工程技术研究院）/广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095］
升阳化浊降糖方系依据张仲景《伤寒杂病论》中理中汤、吴茱萸汤加减而成，为我院经验方，应用多年，方中附子[1−3]、干姜[4]、吴茱萸[5−6]温补脾、肾、肝三阴，复全身阳气的运化、枢转及自生之本，淫羊藿[7]、山萸肉[8]、白芍[9]补阴敛阳，黄芪[10]健脾胃化浊湿而厚阳，甘草补中，诸药合用，共奏温复三阴、散寒化浊之功。
本研究建立了HPLC 同时测定方中莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱9 种成分质量浓度的方法，并以9 种成分的质量浓度和固形物质量的综合评分为评价指标，对加水量、提取时间及提取次数进行考察，对升阳化浊降糖方的提取工艺进行优选，以期为该制剂的后续研究开发奠定基础。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters Arc 型高效液相色谱仪，配2998 型PDA检测器、自动进样器、四元泵、在线脱气机（美国沃特世公司）；Genie G 5超纯水系统（上海乐枫生物科技有限公司）；FA224 TC 电子分析天平（上海力辰仪器科技有限公司）；KQ3200 DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药
马钱苷（批号：11640-201808）、芍药苷（批号：110736-201741）、甘草苷（批号：111610-201607）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号：111920-201907）、淫羊藿苷（批号：110739-201516）、吴茱萸碱（批号：110802-200606）购自中国食品药品生物检定所；吴茱萸次碱（批号：MUST-13050509）、莫诺苷（批号：RDDMO271908031）、甘草酸（批号：G-004-171219）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；附子、干姜等饮片均购自广州采芝林药业有限公司；甲醇、乙腈、四氢呋喃为色谱纯（德国默克公司）；磷酸、甲酸等其余试剂为分析纯（广州化学试剂厂）。
2 方法与结果
2.1 各成分质量浓度测定方法
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Waters Xbridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～20 min，7%A～17%A；20～30 min，17%A～27%A；30～40 min，27%A～37%A；40～60 min，37%A～67%A）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：215 nm（吴茱萸碱、吴茱萸次碱），235 nm（莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸），265 nm（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷）。
2.1.2 溶液的制备
2.1.2.1 对照品储备溶液的制备 取莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为121.89、89.424、172.385、9.636、36.782、26.856、20.800、7.077、3.478µg/mL的对照品储备溶液。
2.1.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密量取“2.1.1”项下各对照品储备溶液1 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，备用。
2.1.2.3 供试品溶液的制备 精密吸取各正交溶液5 mL 置具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液20 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，加甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.1.2.4 阴性对照溶液的制备 分别配制缺山萸肉、白芍、黄芪、甘草、淫羊藿、吴茱萸的阴性提取液，再按“2.1.2.3”项下方法制备各阴性对照溶液，备用。
2.1.3 专属性试验 取混合对照品溶液、各阴性对照溶液及供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图见图1。结果显示，在莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品相应保留时间位置，各阴性对照溶液均无吸收峰。
图1 专属性试验HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of specific tests
2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2.2”项下混合对照品溶液2、4、6、8、10 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇溶液至刻度，配置成系列质量浓度对照品溶液，进样10µL，记录峰面积，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，结果见表1。
表1 线性关系考察结果Table 1 Linear relationship inspection results
2.1.5 精密度试验 取“2.1.4”项下混合对照品溶液（质量浓度3），连续进样6 次，结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积RSD 分别为0.23%、0.17%、0.22%、0.30%、0.25%、0.36%、0.39%、0.41%、0.30%，表明仪器精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 取正交提取液（正交试验5），按“2.1.2.3”项下方法制备供试品溶液，并于制备后的0、1、2、4、8、12 h 分别进样，结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积RSD 分别为1.23%、1.10%、1.05%、0.89%、1.36%、1.39%、1.42%、1.52%、1.59%，表明供试品于室温下放置12 h 内稳定性较好。
2.1.7 重复性试验 取同一正交提取液（正交试验5）6份，分别按“2.1.2.3”项下方法制备供试品溶液并测定峰面积，结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱峰面积RSD 分别为1.47%、1.50%、1.15%、1.37%、1.89%、1.26%、1.29%、1.40%、1.53%，表明方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的提取液（正交试验5）6份，分别精密加入单个对照品储备溶液适量，制备供试品溶液后测定峰面积，计算加样回收率。结果莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱的平均回收率分别为98.47%、96.52%、97.55%、96.78%、98.40%、97.33%、97.21%、97.52%、98.14%，RSD 分别为1.74%、1.89%、1.56%、2.00%、1.92%、1.83%、1.77%、1.86%、1.95%，表明方法准确性良好。
2.2 正交试验
采用L9（34）正交设计方法，对提取次数（A）、提取时间（B）及加水量（C）进行优选，见表2。按处方比例称取附子、干姜、吴茱萸等八味饮片105 g，共9份，按正交试验安排的方法提取，合并煎液，滤过，滤液浓缩并定容至100 mL。
表2 因素水平表Table 2 Factors and levels table
2.2.1 固形物质量的测定 精密量取各正交提取液25 mL，置已干燥恒定质量的蒸发皿中，照2020年版《中国药典》四部通则“0831 干燥失重测定法”测定，计算固形物质量。
2.2.2 正交试验结果 设定莫诺苷（MNG）、马钱苷（MQG）、芍药苷（SYG）、甘草苷（GCG）、甘草酸（GCS）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（MRYHTPTTG）、淫羊藿苷（YYHG）、吴茱萸碱（WZYJ）、吴茱萸次碱（WZYCJ）质量分数及固形物质量的加权系数均为0.1。正交试验结果见表3所示。可见，因素A（提取次数）对试验结果影响最大，其次是加水量，最后是提取时间。表4正交分析结果显示，3个因素的影响均有统计学意义（P＜0.05），考虑到生产的经济和时间成本，最终确定工艺为提取3 次，每次1 h，第1 次加入10倍量水，第2、3次加入8倍量水煎煮。
表3 正交试验设计与结果Table 3 Orthogonal experimental design and results
表4 方差分析结果Table 4 Analysis of Variance Results
2.3 工艺验证试验
按处方比例称取饮片，共3批，按优化的工艺提取并制备供试品溶液，测定指标成分含量，结果见表5。可见，优选的工艺稳定可行。
表5 验证试验结果Table 5 Validation Test Results
3 讨论
升阳化浊降糖方由8 味饮片组成，本试验确定了山萸肉、白芍、甘草、黄芪、淫羊藿及吴茱萸6味饮片中的9 种成分为评价指标，参考《中国药典》2020年版一部各味饮片含量测定方法发现，不同成分的检测波长差异较大，为提高结果的准确率，本试验分别在210 nm 下对吴茱萸碱、吴茱萸次碱；235 nm下对莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸；265 nm 下对毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷进行检测。
本方在我院临床应用多年，疗效显著，为更好地满足现代人的用药需求，拟将其开发为医疗机构中药制剂。查阅文献可知，莫诺苷、马钱苷为山萸肉的主要活性成分，莫诺苷可显著降低高糖所致的糖尿病肾病小鼠模型中甘油三酯及肾脏血脂血糖水平[11]。安淑静等[12]在胰腺β细胞的PI3K/Akt 信号通路中发现马钱苷通过抑制FOXO1 核异位发挥降糖功效；芍药苷能够改善葡萄糖耐受能力及减轻肝组织病理性改变，对T2DM 大鼠糖脂代谢紊乱起到调节的作用，是白芍的主要有效成分[13]；程丽娜等[14]发现甘草酸、甘草苷可以改善胰岛素抵抗，调节脂肪酸合成从而发挥降糖作用；毛蕊异黄酮葡萄糖苷是黄芪中最具活性的成分之一，可以明显提高脂肪细胞的葡萄糖消耗量，降低TG 含量[15]；淫羊藿苷通过激活mTOR/Akt/CREB 通路促进高糖诱导的足细胞自噬抑制细胞凋亡[16]；吴茱萸碱、吴茱萸次碱均为吴茱萸的活性成分，吴茱萸碱具有抗炎、抗肿瘤、抗肥胖和抗性血管等多种药理活性[17]，而吴茱萸次碱可以有效阻止高糖诱发的足细胞受损，以及细胞炎症、焦亡反应[18]。本文主要对其提取工艺参数进行筛选，考虑复方中药制剂起效成分多样，因此选择多个评价指标[19]，可以使得筛选结果更为科学合理。
本文建立了HPLC法同时测定莫诺苷、马钱苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、吴茱萸碱、吴茱萸次碱质量浓度的方法，并以9种成分的质量浓度及固形物质量为提取工艺的评价依据，得到优化的提取参数，即提取3 次，每次1 h，第1 次加入10 倍量水，第2、3 次加入8 倍量水。经过验证证明，优选的工艺重复性良好，为该制剂后续的开发奠定了坚实的基础。
