对照提取物在浙贝母配方颗粒质量分析中的应用研究

陈海燕，吴垠，巫少娟，曾名德，钟健宇，张坚潮，林丹丹，张奕尧，郭隆钢（广州科曼生物科技有限公司，广东 广州 510663）

浙贝母为百合科植物浙贝母FritillariathunbergiiMiq.的干燥鳞茎，具有清热化痰止咳、解毒散结消痈的功效[1]。浙贝母主要化学成分包括生物碱、多糖、总皂苷、黄酮类成分、挥发油和核苷类等[2-3]。其混淆品湖北贝母在外形、颜色上与浙贝母相似，且较易大量繁殖，常有混淆出售的现象[4]。浙贝母配方颗粒是以浙贝母饮片为原料，经过水煎煮提取、减压浓缩、喷雾干燥、制粒等现代工艺制成的单味颗粒剂[5]。浙贝母配方颗粒已失去原有的饮片特征，无法进行传统的性状鉴别，则更容易出现伪品或掺伪品。目前关于浙贝母配方颗粒的研究主要在含量测定方法与工艺研究方面[5-7]，本研究以浙贝母对照提取物（ZBM ERS）（水提，ST）和湖北贝母对照提取物（HBBM ERS）（水提，ST）为参照，通过对不同厂家的浙贝母配方颗粒样品进行高效薄层色谱（HPTLC）和高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析，对其整体质量进行分析及真伪鉴别。

1 仪器、试药与样品

ATS4 薄层色谱全自动点样仪、薄层色谱双槽展开缸、TLC Plate Heater Ⅲ 薄层加热板、TLC visualize 薄层色谱摄像仪（瑞士CAMAG 公司）；HPTLC G60 预制板（德国Merck 公司）；Agilent 1260 series 高效液相色谱仪、Agilent ELSD 检测器（美国Agilent technologies 公司）；色谱纯乙腈、分析纯氨水（德国Merck 公司）；甲醇、乙酸乙酯、三乙胺、乙醇、硫酸、二乙胺均为分析纯（广州化学试剂厂）；纯化水为实验室自制。贝母素甲（批号：110750-201913，含量≥98.4%）、贝母素乙（批号：110751-201712，含量≥97.7%）、湖贝甲素（批号：110859-200503，含量≥97.7%）、浙贝母对照药材（批号：120972-201906，批号：120972-201405）、湖北贝母对照药材（批号：120962-201005），均购自中国食品药品检定研究院；ZBM ERS（ST）（批号：EZBM-ST-20220301）、HBBM ERS（ST）（批号：EHBBM-ST-20220401），广州科曼生物科技有限公司研制；22 批浙贝母配方颗粒样品均为广州科曼生物科技有限公司收集，来源于11个不同的企业（见表1）。

表1 22 批不同厂家浙贝母配方颗粒样品信息Table 1 Sample information of 22 batches of Fritillariae thunbergii bulbus Formula Granules from different manufacturers

2 方法与结果

2.1 HPTLC 指纹图谱分析

2.1.1 供试品制备 化学对照品溶液制备：取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品、湖贝甲素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含贝母素甲和湖贝甲素各1 mg、贝母素乙2 mg的混合溶液，即得。

对照提取物溶液制备：取ZBM ERS（ST）0.5 g，HBBM ERS（ST）0.17 g，分别置于50 mL 离心管中，加水20 mL，超声处理30 min；加入浓氨试液2 mL与乙酸乙酯20 mL，振摇提取，离心；分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇0.5 mL 使溶解，滤过，取滤液即得。

配方颗粒溶液制备：分别取浙贝母配方颗粒0.5 g，按对照提取物溶液方法制备。

对照药材溶液制备：分别取浙贝母和湖北贝母对照药材各1 g，加水20 mL，加热回流30 min，放冷；加入浓氨试液2 mL 与乙酸乙酯20 mL，振摇提取，离心；分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，滤过，取滤液即得。

2.1.2 色谱条件 方法1。薄层板：HPTLC G60 预制板（德国Merck公司）；对照品溶液点样体积1 μL，对照提取物溶液、对照药材溶液和配方颗粒溶液点样体积均为3 μL，条带状点样宽为8 mm，点样后的薄层板于45 ℃加热干燥15 min；展开剂：乙酸乙酯-甲醇-三乙胺-水（17∶1∶1∶0.5）；展开方式：上行展开，展距8.5 cm；显色与检视：展开后将薄层板放于45 ℃加热板中干燥15 min，放冷，然后用10 %硫酸乙醇溶液喷雾显色。于105 ℃加热5 min，分别置于紫外光灯（254 nm和365 nm）及日光下检视[8]，拍照记录并用自编软件扫描得到薄层色谱轮廓图。

方法2。薄层板：HPTLC G60预制板（德国Merck公司）；对照品溶液点样体积2 μL，对照提取物溶液、对照药材溶液和配方颗粒溶液点样体积均为6 μL，条带状点样宽8 mm，点样后的薄层板于45 ℃加热15 min；展开剂：乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17∶2∶1）；展开方式：上行展开，展距8.5 cm；检视：展开后将薄层板放于45 ℃加热板中干燥15 min，放冷，然后用稀碘化铋钾试液喷雾显色。置于日光下检视，拍照记录并用自编软件扫描得到薄层色谱轮廓图。

2.1.3 结果 22 批样品的HPTLC 指纹图谱见图1，扫描得到的HPTLC 指纹图谱轮廓图见图2。根据HPTLC 图谱结果，将22 批样品分类，样品3、4、5、17 图谱（见图1 红色五角星所示）较为接近且具明显的湖北贝母图谱特征，与HBBM ERS（ST）图谱高度相似；样品15、16、18、19、20 与剩余样品HPTLC图谱相比，部分斑点（图1玫红色点所示）颜色较深。作者在研制浙贝母对照提取物（水提）时，发现此部分的斑点经煎煮后斑点颜色会变浅。这几个批次的样品恰好均为台湾或新加坡的企业生产，可能是制备工艺有所不同，导致此部分成分斑点颜色较深[9-10]。 其余样品HPTLC 指纹图谱整体上差异不大，且与ZBM ERS（ST）图谱一致。取两个具有代表性的样品与ZBM ERS（ST）、HBBM ERS（ST）薄层数码扫描轮廓图进行对比，以帮助分析。结果见图2。

图1 浙贝母配方颗粒高效薄层色谱（HPTLC）指纹图谱Figure 1 HPTLC fingerprint of Fritillariae thunbergii bulbus Formula Granules

图2 浙贝母配方颗粒鉴别的薄层扫描图谱Figure 2 HPTLC digital canning images（fingerprints）of Fritillariae thunbergii bulbus Formula Granules

薄层色谱对比结果显示，浙贝母与湖北贝母图谱有两个鉴别区，第一个鉴别区为Rf=0.6～0.9，在这个鉴别区内，湖北贝母比浙贝母多一个湖贝甲素的斑点（图1、图2 绿色点所示），在这区域内的其他斑点为共有成分，但在浙贝母和湖北贝母中的斑点颜色深浅不一样，也体现出各自的特征。第二个鉴别区为Rf=0.1～0.2，在这个鉴别区内，湖北贝母比浙贝母多一个斑点（图1、2 红色点所示）。使用ZBM ERS（ST）和HBBM ERS（ST）为参照，进行HPTLC 检测，可以有效鉴别出样品3、4、5、17具有湖北贝母特征。

2.2 HPLC 指纹图谱分析

2.2.1 供试品制备 同“2.1.1”项下。

2.2.2 色谱条件 色谱仪器：Agilent 1260 series；检测器：Agilent ELSD 检测器；色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.03%二乙胺水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，95%～65%A；15～25 min，65%～60%A；25～30 min，60%～30%A； 30～45 min，30%～23%A； 45～55 min，23%～17%A； 55～60 min，17%-5%A；60～65 min，5%A）；进样量：样品3、4 为2 μL，样品9、18、20、22 为10 μL，其他为5 μL；流速1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测器载气流速：1.6 SLM，蒸发器温度：90 ℃；雾化器温度：80 ℃，Gain值：2；Data Rate：80 Hz。

2.2.3 HPLC 图谱 根据HPLC 分析结果，采用Chem pattern 化学计量学软件进行数据分析处理，生成浙贝母配方颗粒HPLC 指纹图谱共有模式及计算各批样品与ZBM ERS（ST）和HBBM ERS（ST）的相似度。

22 批样品根据HPLC 指纹图谱可以分成两类，见图3。样品3、4、5、17 归为Ⅰ类，其余的样品归为Ⅱ类。两类图谱差异主要体现在以下两点：（1）Ⅰ类图谱比Ⅱ类图谱多了湖贝甲素色谱峰；（2）Ⅰ类图谱贝母素乙的峰明显高于贝母素甲的峰，Ⅱ类图谱则是贝母素甲峰高于贝母素乙峰。两类样品分别生成指纹图谱共有模式，与HBBM ERS（ST）、ZBM ERS（ST）指纹图谱进行对比，结果见图4。Ⅰ类共有模式与HBBM ERS（ST）相似度达到0.909。Ⅱ类的共有模式与ZBM ERS（ST）相似度为0.995，证明HBBM ERS（ST）和ZBM ERS（ST）分别具有这两类样品的特征，分别以HBBM ERS（ST）和ZBM ERS（ST）的指纹图谱为参照图谱，对各样品进行相似度评价，结果见图5和图6。相似度评价结果显示，以HBBM ERS 为参照，Ⅰ类样品相似度均达到0.9 以上，Ⅱ类样品均在0.7以下；以ZBM ERS 为参照，Ⅱ类样品相似度均达到0.9 以上，Ⅰ类样品均在0.75 以下。由此可以说明用HBBM ERS（ST）和ZBM ERS（ST）作为参照，按上述方法进行HPLC 指纹图谱检测，可以明显区分两类样品，同样可以有效鉴别出样品3、4、5、17具湖北贝母指纹图谱的特征。根据HPLC 指纹图谱各峰的响应值，可以判断各样品的质量。样品9、18、20、22 进样量为其他样品的2倍，但是峰的响应值与其他样品相当或甚至比其他样品更低，说明这几批样品的质量较差。

图3 22 批浙贝母配方颗粒样品高效液相色谱（HPLC）图谱Figure 3 HPLC fingerprint of 22 batches of Fritillariae thunbergii bulbus Formula Granules

图4 两类样品指纹图谱的共有模式对比图Figure 4 Comparison chart for common mode of fingerprints of two type of samples

图5 各样品的HPLC 图谱与湖北贝母对照提取物（水提）［HBBM ERS（ST）］比较的相似度分析Figure 5 Similarity analysis of HPLC spectra between each sample and Fritillariae hupehensis bulbus extractive reference substance（HBBM ERS）

图6 各样品的HPLC 图谱与浙贝母对照提取物（水提）［ZBM ERS（ST）］比较的相似度分析Figure 6 Similarity analysis of HPLC spectra between each sample and Fritillariae thunbergii bulbus extractive reference substance［ZBM ERS（ST）］

2.3 含量测定广东省浙贝母配方颗粒标准（粤PFKL00117）[11]规定每1 g 配方颗粒含贝母素甲和贝母素乙的总含量应为1.5～4.5 mg，对收集的22 批样品按浙贝母配方颗粒标准（粤PFKL00117）含量测定项下方法进行测定。结果见表2。产自台湾或新加坡的配方颗粒（样品15、16、18、19、20、22）含量均低于含量下限，样品3含量则超出含量上限。其余样品均符合现有标准。贝母素甲和贝母素乙的含量测定数据显示，样品3、4、5、17 中，贝母素甲含量高于贝母素乙含量，而其他样品中的贝母素乙含量则高于贝母素甲的含量。此结果与HPTLC及HPLC的分类结果相一致。

表2 22 批浙贝母配方颗粒含量测定结果（mg·g-1）Table 2 Results of 22 batches of particle content determination（mg·g-1）

3 讨论

本研究结果显示，浙贝母配方颗粒样品3、4、5和17 的HPTLC 指纹图谱和HPLC 指纹图谱与参照物及其他样品存在明显差异，均检出湖贝甲素，且与湖北贝母指纹图谱特征高度吻合，说明市场上仍存在湖北贝母作为浙贝母投料情况。但目前浙贝母配方颗粒标准中暂无检查项鉴别湖北贝母掺假情况，建议增加以湖北贝母对照提取物（水提）为参照的检查项，遏制掺假行为，保障消费者的用药安全。

对照提取物（水提）是根据广东省中药标准物质研制指导原则征求意见稿，采用不少于15 批的原料按标准汤剂的工艺制备而成的标准物质。与对照药材相比，具有以下优点：①按标准汤剂的工艺标准化制备而成，与配方颗粒工艺相符，适合作为配方颗粒参照物。②多批次原料制成，更具代表性。③混批工艺可实现批间的一致性。④使用方便，使用时无需再进行煎煮处理，提高检测效率。本研究应用浙贝母对照提取物为对照，通过HPTLC 和HPLC 指纹图谱相结合分析方法，能从整体上对浙贝母配方颗粒的质量进行分析，而且能鉴别出湖北贝母的掺入。

另外，在第二类样品中，如图3箭头所示的两个峰在不同的样品中含量存在较大的差异。作者在研究浙贝母对照提取物（水提）的过程中先后用过不同批次的对照药材作为参照，也发现不同批次间的浙贝母对照药材存在这部分峰含量差异较大的现象（见图7），此类浙贝母药材成分含量差异的原因有待进一步研究。

图7 不同批次浙贝母对照药材图谱对比Figure 7 Comparison of HPLC fingerprint for reference substance of different batches of Fritillariae thunbergii bulbus