柴黄清胰活血颗粒通过抑制NLRP3 炎症小体活化减轻重症急性胰腺炎模型大鼠炎症损伤的机制研究

杨佳，李晓渝，姜朝丽，周鑫，李志（.西南医科大学中西医结合学院，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院脾胃病科，四川 泸州 646000；3.西南医科大学附属中医医院泸州市中西医结合防治消化系统疾病重点实验室，四川 泸州 646000）

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是以胰腺广泛炎症反应伴组织坏死为主要特征的临床危重症，病死率高达20%～60%[1-2]。现有研究[3-5]报道中医药治疗重症急性胰腺炎取得了明显的疗效，可通过中药口服、中药灌肠、中药外敷以及针灸等多种方式明显缓解患者症状。部分中药单体和复方能通过调控NLRP3 炎症小体的活化，从而减轻重症急性胰腺炎的炎症反应。研究[6]发现大承气汤能有效抑制高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达及NLRP3 炎症小体活化，抑制炎性因子生成，改善重症急性胰腺炎模型小鼠胰腺功能；丹参提取物通过下调ROSNLRP3 炎症小体信号保护急性胰腺炎肺损伤大鼠的肺组织[7]；左旋紫草素能减轻重症急性胰腺炎大鼠并发急性心肌损伤，其作用可能是通过抑制NLRP3 炎性小体过度活化[8]。

前期研究[9-11]发现，柴黄清胰活血颗粒能改善重症急性胰腺炎炎症反应程度，抑制JAK2/STAT3、IKK/IκB/NF-κB、JNK/ P38MAPK 等信号通路，下调KEAP1 的表达[12]，但尚不清楚其是否对NLRP3 炎症小体活化有调控作用。本研究拟观察柴黄清胰活血颗粒对NLRP3 炎症小体活化的调控作用，进一步明确其改善重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺损伤的机制，为新药开发及临床推广提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD 大鼠，雄性，SPF 级，7～8 周龄，体质量（250±20）g，西南医科大学动物实验中心提供，动物质量合格证号：51203500010170，动物生产许可证号：SCXK（川）2018-17。饲养于西南医科大学动物实验中心，动物实验经西南医科大学动物伦理委员会批准，审批号：20220121-001。

1.2 实验药物柴黄清胰活血颗粒由西南医科大学附属中医医院制剂科提供，批号：20221022，由生大黄、黄芩、栀子、桃仁、赤芍、丹参、柴胡、白芍、枳实、厚朴、延胡索、黄芪、甘草、蒲公英组成，生药含量为2.6 g·g-1。

1.3 主要试剂牛磺胆酸钠，美国Sigma公司，批号：T9034；戊巴比妥钠，天津市河东区红岩试剂厂，批号：170108；MCC950，MedChemExpress 公司，批号：HY-12815A；IL-18 ELISA kit、IL-1β ELISA kit，欣博盛公司，批号分别为：ERC010、ERC007；NLRP3 抗体，美国Affinity 公司，批号：DF7438；ASC 抗体，美国BIOSS 公司，批号：bs-6741R；Caspase-1 抗体，美国Proteintech 公司，批号：22915-1-AP；Pro-Caspase-1 抗体，美国Abcam 公司，批号：ab179515；Prime ScriptTMRT Master Mix、TB Green®Premix Ex TaqTMII，日本Takara 公司，批号分别为：RR036A、RR820A。

1.4 主要仪器自动酶标仪，美国Bioteksynergy 公司；珊顿切片机及珊顿石蜡组织包埋机，美国Ther⁃mofisher Corporation 公司；Mini PROTEAN®Tetra Cell电泳仪，美国BioRad 公司；ECLIPSE 80i 正置显微镜，日本NIKON 公司；Nano-Drop2000 Spectropho⁃tometer，美国Thermo Fisher 公司；LightCycler®480 II荧光定量PCR仪，瑞士Roche公司。

1.5 分组、模型复制及给药方法将64只SPF级雄性SD大鼠随机分为假手术组、重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组及NLRP3抑制剂MCC950组。各组再分为12、24 h 两个亚组（n=8）。所有大鼠术前12 h 禁食、2 h 禁饮。造模参照相关文献研究[13]，采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠法建立重症急性胰腺炎大鼠模型。简要步骤：腹腔注射1%戊巴比妥钠（6 mL·kg-1）麻醉大鼠后，沿腹白线开腹，找出胰胆管在十二指肠的开口。在胰胆管开口对侧肠壁处扎一小孔，经肠壁针孔，沿开口处插入无菌静脉留置针约0.5 cm，血管夹夹闭胰胆管入肝处。使用微泵推注3.5%牛磺胆酸钠（2 mL·kg-1），速率为0.1 mL·min-1，完毕后除去血管夹，缝合关腹。假手术组只需多次翻动胰腺及十二指肠遂可缝合。MCC950 组大鼠重症急性胰腺炎模型制备成功后，立即腹腔注射MCC950溶液（1 mg·mL-1，10 mL·kg-1）1次。术后禁食，自由饮水。大鼠麻醉苏醒后，柴黄清胰活血颗粒组灌服柴黄清胰活血颗粒药液（0.35 g·mL-1，6 mL·kg-1），假手术组及重症急性胰腺炎组灌服生理盐水（6 mL·kg-1），每6 h 1 次。同时关注大鼠精神、活动度、呼吸、心率等一般情况。实验过程符合国家和单位有关实验动物的管理和使用规定。

1.6 标本采集造模后12、24 h收集腹水、腹主动脉血及胰腺组织。12、24 h 两个亚组分别于造模成功后12 、24 h 取材，在取材前2 h 停止灌胃。腹腔注射1%戊巴比妥钠（6 mL·kg-1）麻醉大鼠后沿原切口先用剪刀剪开外层皮肤，嘱助手用4 个血管钳沿左上、左下、右上、右下四个方向分别提拉两侧切口皮肤，充分暴露腹膜层，再用剪刀剪开腹膜层，观察胰腺、肠道大体情况。用注射器抽取腹水再用无菌棉球搌干，腹水量为注射器内体积与棉球湿质量减去干质量之差的和，将1 g腹水折算作1 mL腹水。暴露腹主动脉后，采血针穿刺腹主动脉采血，每只大鼠2 管。室温静置30 min 后，于4 ℃、4 000 r·min-1离心10 min（离心半径20 cm），分装存于-80 ℃冰箱备用。分离胰腺组织，部分固定于4%多聚甲醛，余分装后存于-80 ℃冰箱备用。

1.7 全自动生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶活性一次性真空生化采血管采血，室温静置30 min后，移交至西南医科大学附属中医医院检验室，运用全自动生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶。

1.8ELISA 法检测各组大鼠血清IL-18、IL-1β水平采用ELISA 试剂盒检测各组大鼠血清IL-18 及IL-1β 的水平，具体操作步骤均严格按照说明书进行。

1.9 HE 染色胰腺组织经过4%多聚甲醛溶液固定、梯度脱水、石蜡包埋后，制备成厚5 μm 的切片进行HE 染色。处理好的组织切片交由两位病理科老师采用盲法在光学显微镜下以Schmidt 病理组织评分法[14]对胰腺组织行病理评分。

1.10 免疫组化检测相关蛋白的表达组织蜡块经切片、脱水、复水、枸橼酸100 ℃水浴修复抗原、过氧化物酶阻断、封闭、NLRP3、ASC 及Caspase-1 一抗及相应种属的二抗孵育、显色、苏木精复染、盐酸乙醇分色、脱水、封片，在光镜下观察NLRP3、ASC及Caspase-1 的表达情况。使用Image-Pro Plus 图像处理软件对阳性结果进行半定量分析，结果采用平均光密度值表示（目的蛋白光密度值/图像面积）。

1.11 qRT-PCR 法检测胰腺组织相关基因mRNA 的表达称取100 mg 胰腺组织于预冷的研磨钵中研磨成粉。依次加入Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书分别反转录为cDNA，反转录条件为37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，保持4 ℃。参照TB Green®Premix EX TapTMⅡ试剂盒说明书进行qRT-PCR 检测，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增引物序列见表1。扩增条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火，延伸320 s，40个循环。计算2-△△Ct得出各组相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR 的引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.12 Western Blot 法检测胰腺组织相关蛋白的表达取100 mg 胰腺组织剪碎，加1 mL RIPA 含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的裂解液，裂解完成后以4 ℃、15 000 r·min-1离心15 min。BCA 法测定蛋白含量，将5×的SDS-loading buffer 稀释到1×后加入蛋白中，配置凝胶，上样、转膜、封闭、TBST 漂洗。加入按比例稀释的NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Pro-Caspase-1（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）一抗后，4 ℃过夜；加入二抗（1∶5 000）孵育1 h，信号检测。用ImageJ系统进行结果分析。

1.13 统计学处理方法采用SPSS 26.0 运算，计量资料服从正态分布以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（least significant difference，LSD）分析，组内比较采用独立样本t检验。以P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠术后一般情况观察及大体解剖情况假手术组大鼠活动自如，精神佳，毛发整齐色亮，呼吸心率正常；重症急性胰腺炎组大鼠喜蜷缩，神经萎靡，毛发凌乱色黯，呼吸急促，心率快；与重症急性胰腺炎模型组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组大鼠一般情况好转。假手术组各时间点大鼠腹腔未见明显异常；重症急性胰腺炎组12 h 时腹腔可见明显积液及脏器组织粘连，胰腺色鲜红，充血水肿，可见部分黄绿色脓肿样改变，肠道色紫红，水肿及积气明显，可见皂化斑，与12 h 组比较，24 h 组病变程度加重；与重症急性胰腺炎模型组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组腹腔积液及脏器组织粘连程度减轻，胰腺组织充血水肿及黄绿色脓肿样改变范围减小，肠道肿胀坏死及皂化斑改善，与12 h组比较，24 h组病变程度加重。

2.2 各组大鼠腹水量观察见表2。与假手术组比较，各时间点重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组腹水量均明显增加（P＜0.05）；与重症急性胰腺炎组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点腹水量均减少，差异有统计学意义（P＜0.05）；重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950组腹水量随时间推移而增加，24 h较12 h明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠腹水量的影响（±s，n=8）Table 2 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on ascites quantity in rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

表2 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠腹水量的影响（±s，n=8）Table 2 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on ascites quantity in rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与自身12 h组比较，*P＜0.05

组别假手术组模型组柴黄清胰活血颗粒组MCC950组F值P值12 h/mL 1.15±0.48 7.95±0.91#3.50±0.58#△4.05±0.44#△160.291＜0.001 24 h/mL 1.35±0.51 9.30±1.06#*6.31±3.74#△*6.97±5.44#△*169.039＜0.001 t值0.802 2.741 8.460 13.333 P值0.436 0.016＜0.001＜0.001

2.3 血清淀粉酶、脂肪酶、IL-18、IL-1β 的变化见图1。与假手术组比较，重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点淀粉酶、脂肪酶、IL-18、IL-1β 含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与重症急性胰腺炎模型组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点淀粉酶、脂肪酶、IL-18、IL-1β 含量均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；重症急性胰腺炎模型、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组淀粉酶、脂肪酶含量随时间推移而降低，24 h 较12 h 明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。重症急性胰腺炎模型组IL-18、IL-1β含量随时间推移而上升，24 h 较12 h 明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠血清淀粉酶活性、脂肪酶、IL-18 及IL-1β 含量的影响（±s，n=8）Figure 1 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on serum amylase activity，serum lipase，serum IL-18 and IL-1β in rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

2.4 各组胰腺组织病理HE 染色结果见图2。假手术组各时间点胰腺组织结构未见明显损伤。重症急性胰腺炎组术后12 h，胰腺组织出现明显的病理改变，小叶间隔扩张，伴炎症灶聚集及红细胞渗出；重症急性胰腺炎组术后24 h 胰腺组织病理改变加重。与假手术组比较，各时间点重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组胰腺组织病理评分均明显上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与重症急性胰腺炎模型组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组病理的胰腺组织病理改变明显减轻，小叶间隙稍增宽，轻度充血水肿，病变范围缩小，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点胰腺组织病理评分均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组病理评分随时间推移而上升（P＜0.05），24 h 较12 h明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠病理结构及胰腺组织病理评分的影响（×200；±s，n=8）Figure 2 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on the pathological structure and pathological score of pancreatic tissues in rats with severe acute pancreatitis（×200；±s，n=8）

2.5 免疫组化检测NLRP3、ASC、Caspase-1 表达见图3、图4。假手术组各时间点NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白呈弱阳性表达，重症急性胰腺炎模型组各时间点NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白呈强阳性表达，阳性细胞呈棕黄色，主要分布于胞质，表现为颗粒和块状。与假手术组比较，重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与重症急性胰腺模型炎组比较，柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组各时间点NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表达水平均降低（P＜0.05），且随时间推移而上升，24 h较12 h明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 免疫组化法（IHC）检测大鼠胰腺组织NLRP3、ASC 和Caspase-1 表达（×200）Figure 3 Expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in the pancreatic tissues of rats by IHC（×200）

图4 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织NLRP3、ASC 和Caspase-1 蛋白表达水平的影响（±s，n=8）Figure 4 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on protein expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in pancreatic tissues of rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 的表达见图5。与假手术组比较，各时间点重症急性胰腺炎模型组、柴黄清胰活血颗粒组、 MCC950组的NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 表达水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与重症急性胰腺炎模型组比较，柴黄清胰活血颗粒组、 MCC950 组的各时间点NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA 表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；重症急性胰腺炎模型组NLRP3 mRNA表达水平随时间推移而上升，24 h 较12 h 明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图5 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织NLRP3、ASC 和Caspase-1 mRNA 表达水平的影响（±s，n=8）Figure 5 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on mRNA expressions of NLRP3，ASC and Caspase-1 in pancreatic tissue of rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

2.7 Western Blot 法检测 NLRP3、 ASC、 Pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白的表达见图6、图7。与假手术组比较，各时间点重症急性胰腺炎模型组大鼠胰腺组织中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白的表达水平均上升，差异有统计学意义（P＜0.05）；与重症急性胰腺炎模型组比较，各时间点柴黄清胰活血颗粒组、MCC950 组大鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1、Caspase-1 蛋白表达水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与自身12 h 组比，24 h 的柴黄清胰活血颗粒组及MCC950 组表达水平的差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图6 各组对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1 和Caspase-1 蛋白表达影响的条带图Figure 6 Bar graphs for the protein expressions of NLRP3，ASC，Pro-Caspase-1 and Caspase-1 in pancreatic tissues of rats with severe acute pancreatitis

图7 柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1 和Caspase-1 蛋白表达水平的影响（±s，n=8）Figure 7 The effects of Chaihuang Qingyi Huoxue Granules on protein expressions of NLRP3，ASC，Pro-Caspase-1 and Caspase-1 in pancreatic tissue of rats with severe acute pancreatitis（±s，n=8）

3 讨论

急性胰腺炎病名在中医古籍中并无记载。《杂病源流犀烛·心病源流》论“腹胀胸满，胃脘当心痛，上支两胁，咽膈不通，胃心痛也”；《灵枢·厥病》曰“厥心痛，痛如以锥针刺其心，心痛甚者，脾心痛也”，故将急性胰腺炎归属于“胃心痛”“脾心痛”等病证范畴[15]。柴黄清胰活血颗粒是根据西南医科大学附属中医医院多年用于治疗重症急性胰腺炎的经验方而制成的颗粒制剂，其主要由生大黄、柴胡、赤芍、黄芩等组成，具有行气活血、清热解毒的功效，改善重症急性胰腺炎的临床疗效确切[16-17]。

本研究发现，给予柴黄清胰活血颗粒灌胃后，重症急性胰腺炎大鼠一般情况好转，精神、腹部膨隆、呼吸、心率情况改善，腹水、组织脏器粘连、胰腺组织病变情况减轻；血清淀粉酶、脂肪酶降低。

前期研究[18-20]发现，柴黄清胰活血颗粒可改善重症急性胰腺炎模型大鼠胰腺炎症损伤。本研究发现，给药后重症急性胰腺炎模型大鼠血清IL-18、IL-1β含量降低；HE 染色显示胰腺组织病理损伤明显减轻，胰腺组织充血水肿情况得到改善，坏死、炎症灶聚集及红细胞渗出明显减少，病变范围缩小，组织病理评分明显降低。但本方的抗炎机制尚不完全清楚。

近年来，炎症小体过度活化在各种炎性相关疾病中的作用越来越引起研究者的兴趣[21]，其中NLRP3炎症小体的研究最为广泛[22]。NLRP3炎症小体是一种多蛋白的复合物，其构成天然免疫的重要组成部分[23]，由受体蛋白NLRP3、衔接蛋白ASC、效应蛋白Pro-Caspase-1 组成[24]。NLRP3 炎症小体的异常激活与重症急性胰腺炎的发生发展有着紧密的联系。重症急性胰腺炎发生时受损的胰腺腺泡细胞释放大量的细胞内容物，包含病原相关分子模式（Pathogen associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关分子模式（Danger associated molecular patterns，DAMPs）DAMPs，刺激NLRP3 的活化。激活的NLRP3 通过诱导下游的ASC 和Pro-Caspase-1 蛋白，形成完整的NLRP3 炎症小体[25]，并将Pro-Caspase-1 切割成Caspase-1，促进Pro-IL-1β 和Pro-IL-18 的分化成熟和分泌，诱导炎症级联反应，进一步促进重症急性胰腺炎病情发展[26-27]。故NLRP3 炎症小体的活化介导IL-1β、 IL-18 等炎性细胞因子过度释放在重症急性胰腺炎疾病的发生及发展中起着关键作用，抑制炎症小体的激活可能改善重症急性胰腺炎。

研究[28]表明原花青素能通过降低活性氧（ROS）水平，抑制NLRP3 炎症小体和M1 巨噬细胞极化来减轻重症急性胰腺炎。有研究[29]采用NLRP3 过表达及敲低小鼠建立重症急性胰腺炎模型，证实NLRP3-/-小鼠胰腺和肺的病理损伤、炎症反应和中性粒细胞浸润明显减轻，表明降低NLRP3 的表达可以减轻重症急性胰腺炎相关的炎症和急性肺损伤。研究[30]发现夹竹桃麻素能通过抑制NADPH 氧化酶而下调肺中NLRP3、ASC、Pro-Caspase-1 和Caspase-1 等炎性体蛋白的水平，同时降低血清TNF-α、 IL-1β、 IL-6水平，夹竹桃麻素能减轻重症急性胰腺炎和重症急性胰腺炎所致肺损伤。

综上所述，柴黄清胰活血颗粒对重症急性胰腺炎模型大鼠的胰腺损伤有保护作用，机制可能与抑制NLRP3 炎症小体过度活化，减少下游炎症因子过度释放有关。本研究为柴黄清胰活血颗粒治疗重症急性胰腺炎的临床应用和推广提供了科学依据。