补脾益肠丸通过抑制溃疡性结肠炎模型小鼠糖酵解代谢途径发挥抗炎作用的机制研究

肖秋萍，黄佳琦，万琪，施旻，李姗姗，刘端勇，陈丽玲，钟友宝，（.江西中医药大学实验动物科技中心，江西 南昌 0004；.江西中医药大学研究生院，江西 南昌 0004；.江西中医药大学方证研究中心，江西 南昌 0004）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克罗恩病（crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），属于慢性非特异性肠道炎症[1]；在中医理论中属于“痢疾”“久痢”等范畴[2]。随着工业化快速发展、饮食结构西方化，我国溃疡性结肠炎的发病率和复发率逐年攀升[3]。溃疡性结肠炎临床上反复发作且难以彻底治愈，世界卫生组织（WHO）已将溃疡性结肠炎列为十大难治性疾病之一[4]。氨基水杨酸、糖皮质激素、新型免疫抑制剂等药物广泛用于快速缓解溃疡性结肠炎症状，但其疗效不足、治愈率低、药物依赖性大、费用高等局限性导致溃疡性结肠炎治疗仍是医疗的重大挑战[5]。因而，寻找更加安全、有效、可靠的治疗药物已然迫在眉睫。

补脾益肠丸（BupiYichangPills）是临床治疗溃疡性结肠炎的常用方剂，主治溃疡性结肠炎、慢性结肠炎等[6]。纳入835 例溃疡性结肠炎患者的Meta 分析结果[15]显示，补脾益肠丸联合常规疗法干预溃疡性结肠炎能提高临床总有效率，减少不良反应，并改善结肠黏膜症状评分。在单一用药治疗溃疡性结肠炎的案例[7]中，补脾益肠丸临床疗效明显优于西药组，腹痛、腹泻、黏液便等症状明显改善，然而其具体作用机制尚未见报道。

据研究[8]报道，糖酵解信号通路在溃疡性结肠炎的发生与发展中扮演关键性角色。溃疡性结肠炎患者肠道黏膜受损，糖酵解相关酶活性和基因表达明显增加，而过度激活的糖酵解会加重溃疡性结肠炎患者能量代谢紊乱[9]。此外，糖酵解信号通路与炎症反应密切相关，可通过多种途径调节炎症反应进程[10]。中医药可通过干预糖酵解代谢途径，改善肠道炎性环境从而有效缓解溃疡性结肠炎[11]；如清肠温中方可通过抑制糖酵解代谢而调控CD4+TRM 细胞免疫稳态有效治疗溃疡性结肠炎[12]。溃疡性结肠炎的典型特征是病情迁延不愈、反复发作[13-14]，降低复发率是治疗关键，而有报道称补脾益肠丸治疗溃疡性结肠炎不仅疗效好且复发率低[15]。

本研究旨在基于糖酵解途径，拟采用复发性结肠炎模型揭示补脾益肠丸缓解溃疡性结肠炎并抑制复发的具体作用机制，以期为补脾益肠丸治疗溃疡性结肠炎提供科学依据，并丰富中医理论内涵。

1 材料与方法

1.1 动物7～8 周龄SPF 级C57BL/6 雄性小鼠，体质量20～24 g（动物质量合格证号： 202132170），购于南京集萃药康公司，动物生产许可证号：SCXK（苏）2018-0008。动物饲养于江西中医药大学实验动物科技中心屏障环境内。小鼠自由饮水，采食标准全价饲料，饲养环境：温度22～24℃，湿度50%～60%。本研究方案得到江西中医药大学动物伦理委员会的批准，批准号：JZLLSC2020-234，整个实验操作过程遵守实验动物标准操作规范。

1.2 药物及试剂补脾益肠丸，购于白云山陈李济药厂有限公司，批号：K05190，组方为黄芪、米炒党参、砂仁、白芍、当归、白术、肉桂、醋延胡索、荔枝核、炮姜、炙甘草、防风、木香、盐补骨脂、煅赤石脂；葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS；分子量36～50 kDa），批号：160110，购于美国MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪（Mesalazine，5-ASA，批号：89-57-6），购于美国Sigma-Aldrich公司；戊巴比妥钠（批号：1014P035），购于美国Sigma 公司；M5 HiPer Universal RNA Mini Kit（批号：MF167）、M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover（批号：MF166）、SYBRgreen Mix（批号：MF-015），均购于北京聚合美生物技术有限公司；小鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α（批号：88-7324-88）、白细胞介素（IL）-1β（批号：BMS6002）、IL-6（批号：88-7064-22）、IL-10（批号：88-7105-22）、转化生长因子（TGF）-β1（批号：BMS608-4）酶联免疫吸附试验试剂盒，均购于美国Thermo Scientific 公司；IL-35酶联免疫吸附试验试剂盒（批号：E-EL-H2443c），购于武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；Anti-PKM2抗体（批号：ab137791）、Anti-Aldolase 抗体（批号：ab252953）、Anti-Glut1 抗体（批号：ab115730）、Anti-Glut4 抗体（批号：ab313775）、Anti-HK2 抗体（批号： ab209847）、 Anti- Glut2 抗体（批号：ab54460），均购于英国Abcam公司。

1.3 主要仪器HistoCore_Arcadia 型全自动包埋机、Leica2245 型石蜡切片机、DM2500 型多人共览显微镜，德国Leica 公司；Multiskan Spectrum 型全波长酶标仪，美国Thermo 公司；Milli-Q Advantage A10 型超纯水仪，美国密理博公司；LightCycle 96型荧光定量PCR 仪，瑞士Roche 公司；UVP ChemStudio 型化学发光成像仪，德国Analytikjena公司。

1.4 方法

1.4.1 溃疡性结肠炎模型建立及给药 小鼠适应性饲养3 d，随机分成空白对照组，模型组，低、中、高剂量补脾益肠丸组，美沙拉嗪组，空白补脾益肠丸组。溃疡性结肠炎模型的建立[12]：模型组和低、中、高剂量补脾益肠丸组、美沙拉嗪组小鼠于实验第0～7 天和第14～21 天自由饮用2.5% DSS 溶液，第7～14 天自由饮水。补脾益肠丸和美沙拉嗪预先溶解于生理盐水，根据补脾益肠丸临床剂量（每天3 次，每次6.0 g）[6]及体表面积换算[16]，低、中、高剂量补脾益肠丸组和空白补脾益肠丸组小鼠于实验第7～21天分别灌胃1.5、3.0、6.0、6.0 g·kg-1·d-1补脾益肠丸[17]，美沙拉嗪组小鼠灌胃300 mg·kg-1·d-1美沙拉嗪，而空白对照组及模型组小鼠灌胃等体积生理盐水。

1.4.2 疾病活动指数（disease active index，DAI） 整个实验过程，每天同时间各组小鼠称质量并观察粪便黏稠度、便血情况，根据公式计算：DAI=体质量损失评分+粪便黏稠度评分+便血情况评分，DAI评价标准参考以往研究[18]。

1.4.3 结肠长度、质量及指数 小鼠于实验第21天采用2%戊巴比妥钠深度麻醉安乐死，迅速打开腹腔并分离整个结肠，测量结肠长度；预冷的PBS溶液清洗肠腔内容物，滤纸吸干，结肠称质量并计算结肠质量指数（结肠质量指数=结肠质量/小鼠体质量×100%）。

1.4.4 病理组织技术分析结肠损伤 取近端结肠2 cm，置于4%多聚甲醛溶液中固定，流水冲洗，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成4 μm 切片。常规苏木素-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色，在光学显微镜下采集图片，基于炎性细胞浸润和溃疡形成[13]，由2 位病理学老师随机、盲法对结肠病理图片进行病理损伤评分。

1.4.5 Elisa 法检测炎性细胞因子水平 RIPA 溶液裂解结肠组织，组织匀浆均质化，离心取上清液。BCA法检测上清总蛋白浓度，1×PBS标准化至2 000 ng·mL-1。根据Elisa 法检测试剂盒说明，检测结肠组织促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 和抗炎性细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 浓度，酶标仪读取450 nm 处吸光度值，基于标准曲线计算细胞因子浓度。

1.4.6 qPCR 法检测炎性细胞因子及糖酵解激酶基因表达 提取结肠组织总RNA，酶标仪检测总RNA 浓度，普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性，将RNA逆转录为cDNA，采用SYBRgreen Mix 试剂盒进行实时荧光定量检测，具体步骤参照试剂盒说明书。基因名称和引物序列见表1，qPCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。以GAPDH 为管家基因，根据公式2-ΔΔCt计算炎性细胞因子及糖酵解激酶基因的表达水平。

表1 基因名称及引物序列Table 1 Gene names and primer sequences

1.4.7 Western Blot法检测糖酵解激酶蛋白表达 RIPA裂解组织结肠组织，组织匀浆，破碎仪均质化，4 ℃、13 000×g离心10 min，收集上清液。BCA法检测总蛋白浓度，标准化至3 000 ng·mL-1，加Loading buffer沸腾10 min。制备10%聚丙烯酰胺凝胶，120 V条件下电泳；200 mA 条件下转PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭；一抗（Glut1，Glut2，Glut4，HK2，Aldolase A，PKM2）4 ℃孵育过夜，相应二抗特异性结合，ECL发光液显影，化学发光成像仪可视化成像。

1.5 统计学处理方法采用SPSS 22.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示；组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 补脾益肠丸抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎DSS诱导的结肠炎可模拟人类结肠炎发病过程，常用于溃疡性结肠炎发病机制及抗结肠炎新药研发[19]。在整个研究过程中，观察到DSS诱导的结肠炎小鼠精神状态、体质量、腹泻、便血等情况表现出先变差再转好继而变差的现象，而DAI评分亦呈现先上升后下降再上升的趋势（图1）。与空白对照组比较，模型组结肠炎小鼠体质量、结肠长度均明显下降（P＜0.01），DAI、结肠质量、结肠质量指数、单位结肠质量指数明显上升（P＜0.01）（图1、表2）。光学显微镜下观察到模型组结肠炎小鼠结肠黏膜上皮破损脱落、大量溃疡形成和炎性细胞浸润（图2），其组织病理损伤评分（表2）明显高于空白对照组（P＜0.01）。这些结果表明DSS成功诱导了小鼠实验性结肠炎，且症状出现复发性。

图1 各组小鼠疾病活动指数（DAI）和结肠长度Figure 1 Disease activity index（DAI）and colonic length of mice in each group

图2 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠结肠组织损伤（HE 染色）Figure 2 Bupi Yichang Pills inhibited colonic tissue damage in colitis mice（HE staining）

表2 补脾益肠丸对结肠炎小鼠的疗效评价（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

表2 补脾益肠丸对结肠炎小鼠的疗效评价（±s，n=10）Table 2 Therapeutic evaluation of Bupi Yichang Pills on colitis mice（±s，n=10）

注：与空白对照组相比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组低剂量补脾益肠丸组中剂量补脾益肠丸组高剂量补脾益肠丸组美沙拉嗪组空白补脾益肠丸组结肠组织病理损伤评分/分0.20±0.04 5.11±0.74**3.80±1.17#2.60±0.92##1.91±0.67##2.36±0.77##0.10±0.30剂量/(g·kg-1)--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0体质量/g 25.30±1.12 21.22±1.13**22.56±1.29#23.69±1.32##24.03±1.41##23.77±1.35##25.14±1.12结肠质量/g 0.24±0.02 0.34±0.04**0.31±0.03 0.28±0.03##0.26±0.03##0.27±0.03##0.25±0.02结肠质量指数/%0.95±0.09 1.60±0.20**1.37±0.14#1.18±0.16##1.08±0.19##1.14±0.21##1.00±0.10结肠长度/cm 8.79±0.32 7.36±0.43**7.68±0.51 7.83±0.42#8.03±0.39##7.89±0.43##8.65±0.40单位结肠质量指数/%2.73±0.36 4.62±0.57**4.04±0.49#3.58±0.52##3.24±0.48##3.42±0.51##2.89±0.36

由图1 和表2 可知，与模型组比较，低、中、高剂量补脾益肠丸组和美沙拉嗪组小鼠体质量明显上升（P＜0.05，P＜0.01），而DAI、结肠质量指数、单位结肠质量指数明显性下降（P＜0.05，P＜0.01）；此外，中、高剂量补脾益肠丸组和美沙拉嗪组小鼠结肠质量明显低于模型组（P＜0.01），而结肠长度明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。观察病理组织发现低、中、高剂量补脾益肠丸和美沙拉嗪给药处理的结肠炎小鼠，结肠黏膜上皮较完整且溃疡形成和炎性细胞浸润较少（图2），其组织病理损伤评分（表2）明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。此外，空白补脾益肠丸组小鼠的体质量、结肠质量、结肠质量指数、结肠长度、单位结肠质量指数与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。这些结果表明补脾益肠丸可有效地抑制DSS诱导的结肠炎，疗效呈剂量依赖性。

2.2 补脾益肠丸抑制促炎性细胞因子的表达促炎性（TNF-α、IL-1β 和IL-6）和抗炎性细胞因子（IL-10、IL-35 和TGF-β1）之间的平衡决定着结肠炎发病和缓解的进程[20]。由表3 可知，模型组结肠炎小鼠结肠组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和浓度均明显高于空白对照组（P＜0.01）。与模型组比较，除低剂量补脾益肠丸组的TNF-α 浓度外（P＞0.05），各剂量补脾益肠丸组和美沙拉嗪组小鼠结肠组织中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的mRNA 水平和浓度均明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。此外，与空白对照组比较，空白补脾益肠丸组TNF-α、IL-1β和IL-6 的mRNA 水平和浓度的差异均无统计学意义（P＞0.05）。这些结果表明补脾益肠丸抑制了结肠炎小鼠结肠组织中促炎性细胞因子的表达。

表3 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠结肠组织中促炎性细胞因子表达（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表3 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠结肠组织中促炎性细胞因子表达（±s，n=6）Table 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组低剂量补脾益肠丸组中剂量补脾益肠丸组高剂量补脾益肠丸组美沙拉嗪组空白补脾益肠丸组剂量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH为内参）浓度/（pg·mL-1）IL-6 975.26±62.13 1423.23±132.23**1225.13±92.53#1054.55±86.29##903.12±85.21##1033.22±104.52##1042.13±121.23--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 TNF-α 1.15±0.24 4.25±0.93**3.25±0.75#2.63±0.54##1.92±0.32##2.04±0.51##1.33±0.35 IL-1β 1.33±0.41 4.62±0.91**3.11±0.79##2.54±0.61##1.61±0.46##2.27±0.51##1.72±0.53 IL-6 0.92±0.25 2.48±0.57**2.14±0.51##1.71±0.37##0.89±0.41##1.25±0.31##0.25±0.03**TNF-ɑ 92.2±5.21 230.11±19.53**216.23±23.72 180.25±16.71##150.33±15.52##140.25±20.10##95.81±9.82 IL-1β 113.02±26.28 270.25±30.15**221.45±31.32#188.75±26.31##167.35±24.57##203.12±20.15##102.45±18.62

2.3 补脾益肠丸促进抗炎性细胞因子的表达由表4可知，模型组结肠炎小鼠结肠组织中抗炎性细胞因子IL-10、IL-35和TGF-β1的mRNA 水平及浓度均明显低于空白对照组（P＜0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量补脾益肠丸组及美沙拉嗪组结肠炎小鼠结肠组织中的IL-10 和TGF-β1 的mRNA 水平及浓度均明显上升（P＜0.01），且中、高剂量补脾益肠丸组及美沙拉嗪组结肠炎小鼠结肠组织中的IL-35 的mRNA 水平及浓度均明显上升（P＜0.01）。这些结果表明补脾益肠丸可促进结肠炎小鼠结肠组织中抗炎性细胞因子表达。

表4 补脾益肠丸促进结肠炎小鼠结肠组织中抗炎性细胞因子表达（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

表4 补脾益肠丸促进结肠炎小鼠结肠组织中抗炎性细胞因子表达（±s，n=6）Table 4 Bupi Yichang Pills promoted the expression of anti-inflammatory cytokines in colon tissues of colitis mice（±s，n=6）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组低剂量补脾益肠丸组中剂量补脾益肠丸组高剂量补脾益肠丸组美沙拉嗪组空白补脾益肠丸组剂量/（g·kg-1）mRNA水平（以GAPDH为内参）浓度/（pg·mL-1）TGF-β1 75.23±9.36 20.11±3.56**26.36±3.89##35.51±4.22##40.56±5.87##38.44±5.21##80.23±10.95--1.5 3.0 6.0 0.3 6.0 IL-10 1.29±0.21 0.13±0.02**0.25±0.03##0.38±0.04##0.52±0.06##0.62±0.07##1.57±0.36 IL-35 1.15±0.19 0.31±0.04**0.35±0.05 0.48±0.04##0.67±0.11##0.57±0.09##0.98±0.14 TGF-β1 0.97±0.22 0.26±0.05**0.47±0.06##0.61±0.11##0.77±0.14##0.52±0.09##1.24±0.21*IL-10 26.21±3.56 5.32±0.74**7.12±1.13##9.65±1.67##11.35±2.03##10.36±1.87##30.22±4.32 IL-35 1.53±0.22 0.55±0.08**0.61±0.09 0.85±0.12##0.93±0.19##0.89±0.15##1.39±0.21

2.4 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶基因表达结肠组织伴随着糖酵解过度活化的能量代谢紊乱是结肠炎发病的典型特征之一[21]。见表5，与空白对照组比较，模型组小鼠结肠组织中Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Pfkm、PEPCK2、Aldolase A 和PKM2的mRNA 水平明显上升（P＜0.01）。高剂量补脾益肠丸给药处理后明显降低了Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A和PKM2的mRNA水平（P＜0.01）。

表5 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶基因的表达（±s，n=6）Table 5 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic metabolic kinase gene in colitis mice（±s，n=6）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组高剂量补脾益肠丸组空白补脾益肠丸组剂量/（g·kg-1）mRNA的相对表达量PKM2 1.13±0.17 4.87±0.67**2.14±0.41##1.23±0.26--6.0 6.0 Glut1 1.05±0.15 4.52±1.32**1.47±0.23##0.89±0.22 Glut2 1.22±0.20 6.08±0.66**1.81±0.29##1.42±0.33 Glut4 0.95±0.17 21.35±3.05**3.87±0.48##1.32±0.41 HK2 1.13±0.26 11.32±2.53**3.95±0.42##2.87±0.61**Pfkm 1.18±0.18 2.64±0.55**2.35±0.62 1.36±0.34 PEPCK2 1.13±0.21 3.44±0.94**2.66±0.89 0.93±0.21 Aldolase A 0.91±0.22 3.35±0.72**1.23±0.21##0.82±0.16

2.5 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶蛋白表达由图3 及表6 可知，模型组结肠炎小鼠的结肠组织中糖酵解激酶Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平明显高于空白对照组（P＜0.05，P＜0.01）；补脾益肠丸给药处理后，高剂量补脾益肠丸组的Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A、PKM2 蛋白水平均明显低于模型组（P＜0.01）。这些结果表明补脾益肠丸可抑制DSS 诱导的结肠炎小鼠糖酵解途径活化。

图3 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶蛋白表达Figure 3 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase protein in colitis mice

表6 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶蛋白表达（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

表6 补脾益肠丸抑制结肠炎小鼠糖酵解激酶蛋白表达（±s，n=3）Table 6 Bupi Yichang Pills inhibited the expression of glycolytic kinase in colitis mice（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组高剂量补脾益肠丸组空白补脾益肠丸组剂量/（g·kg-1）以GAPDH为内参的蛋白相对表达量PKM2 0.53±0.17 0.77±0.21*0.43±0.11##0.24±0.05**--6.0 6.0 Glut1 2.15±0.39 3.08±0.18**2.02±0.21##1.92±0.36 Glut2 0.38±0.04 0.95±0.28**0.33±0.04##0.36±0.03 Glut4 0.89±0.14 1.42±0.23**0.91±0.21##1.03±0.28 HK2 0.91±0.24 1.62±0.29**0.89±0.23##0.88±0.36 Aldolase A 1.58±0.19 2.54±0.31**1.35±0.17##1.42±1.20

3 讨论

溃疡性结肠炎中医辨证分型为大肠湿热、肝郁脾虚、脾气虚弱、脾肾阳虚等不同证型[22]。脾虚气滞型溃疡性结肠炎是由于脾胃气虚导致中焦运化失常，进而引发痢疾和泄泻；其患者出现的慢性腹泻、黏液便或脓血便、腹痛、里急后重等症状呈慢性反复发作或持续性，并伴有神疲乏力、纳谷不香、口淡不渴、舌淡胖大、苔白腻、脉缓弱等特征，属于本虚标实的证候[23]。补脾益肠丸常用于治疗溃疡性结肠炎、慢性结肠炎脾虚气滞所致的泄泻证候[6]。补脾益肠丸含内外2层，外层以黄芪、党参等七味益气药为主，针对腹泻、神疲乏力等脾胃虚弱症状而专补脾气；内层以延胡索、赤石脂等八味行气止泻药为主，针对泄泻里急后重、下痢脓血等结肠炎典型症状而重在止泻。在本研究中观察到小鼠结肠炎症状出现了首发、缓解与复发，表现为小鼠精神状态、腹泻等症状及DAI评分由差转好再转差的现象，说明此模型具有复发性结肠炎特征；而补脾益肠丸呈剂量赖性地有效缓解DSS诱导的实验性结肠炎相关症状，明显逆转小鼠体质量减轻、结肠长度缩短、结肠质量增加、单位结肠质量指数上升及结肠黏膜组织损伤。美沙拉嗪是治疗轻、中度溃疡性结肠炎患者的首选药物，也常作为阳性对照药评估新型抗溃疡性结肠炎药物的疗效[24]。我们发现高剂量补脾益肠丸对结肠炎小鼠的疗效与阳性对照药美沙拉嗪效果相近，进一步展示了补脾益肠丸治疗溃疡性结肠炎的潜力。

补脾益肠丸中，黄芪与党参为君药，党参益气健脾和胃，黄芪补中益气，托毒排脓，养血生肌。白术、砂仁为臣药，共助君药健脾理气，祛除因脾虚所致体内湿停。肉桂、干姜温中止痛，补骨脂温补脾肾，白芍、当归养血调血，延胡索、荔枝核、木香行气止痛，符合治痢思想。赤石脂涩肠止泻止血，防风祛风散湿，甘草调和诸药。全方组方严谨，通过健脾和胃、补益气血，调节机体平衡，有效改善溃疡性结肠炎引起的临床症状。细胞因子风暴是溃疡性结肠炎发病的典型特征，表现为促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6过度分泌，而抗炎因子IL-10、IL-35、TGF-β1 低表达[25]。临床研究[26]表明，靶向阻断细胞因子（TNF-α、IL-1β 和IL-6），有助于缓解持续的结肠黏膜炎症。黄芪、党参的有效组分黄芪多糖、党参多糖可有效抑制促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达[27-28]。本研究中，结肠炎小鼠经补脾益肠丸口服给药，结肠组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6浓度呈剂量依赖性下降，而抗炎性细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 呈剂量依赖性上升，表明补脾益肠丸可有效抑制结肠炎症反应。

中医认为，脾主运化水谷精微，是人体生化过程的基础，而脾胃功能失调是溃疡性结肠炎的主要病机之一。现代生理学则认为，能量代谢是一切生命活动的基础。水谷作为能量的来源，通过新陈代谢转化能量以维持人体的正常生命活动；而糖酵解是能量代谢中不可缺少的环节。单样本基因组富集分析显示，与健康对照组比较，IBD 肠道样本中的糖酵解明显升高[29]；肠道上皮细胞能量代谢出现重编程，糖酵解代谢过度活化以维持慢性炎症[30]。能量代谢重编程在慢性结肠炎的发展过程中扮演关键性角色，特征为葡萄糖的极剧消耗，糖酵解的活性增强[31]，Glut、LDHA、PFK、PKM2 酶活性过度活化，炎性因子IL-6 高表达；并且能量代谢方式异常与活跃的黏膜炎症密切相关[32]。研究[33-34]发现，在DSS 诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织中，糖酵解关键酶HK2、LDHA、PFK、PKM2 表达升高，炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6等含量亦升高。临床上小分子靶向干预葡萄糖转运蛋白及糖酵解代谢关键激酶（包括Glut、HK、PKM2）能有效调节炎性细胞因子表达，表明干预能量代谢途径是抑制肠道炎症反应的有效措施[35]。而中药成分黄芪皂苷能明显下调结肠炎小鼠有氧糖酵解途径及LDH、Glut、HK2、c-Myc 蛋白表达，并减弱炎症反应[36]。同样，本研究发现补脾益肠丸也能抑制结肠炎小鼠糖酵解代谢，表现为Glut1、Glut2、Glut4、HK2、Aldolase A 和PKM2 蛋白及基因表达水平明显下降，炎性细胞因子基因表达及含量被调节；而补脾益肠丸对正常小鼠的糖酵解代谢激酶表达及炎性细胞因子水平均无明显影响，这表明糖酵解代谢途径是补脾益肠丸抗结肠炎的关键作用靶点。

综上所述，补脾益肠丸对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有明显的保护性作用。补脾益肠丸可明显抑制结肠组织中促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达，且促进抗炎细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β1 表达，这与其抑制糖酵解信号通路密切相关。本研究阐释了补脾益肠丸通过抑制糖酵解代谢通路抗结肠炎的作用机制，可为补脾益肠丸临床治疗溃疡性结肠炎提供科学依据。