基于UHPLC-Q-TOF/MS 技术分析肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分

张钟康，卢晓南，卢震，胡佳，刘慧珍，卢婷，尚广彬（1.江西中医药大学中医基础理论分化发展中心，江西 南昌 000；2.江西省中医病因生物学重点实验室，江西 南昌 000；.江西中医药大学中医学院，江西 南昌 000；.江西中医药大学临床医学院，江西 南昌 000）

免疫性血小板减少症（Immune thrombocytopenia，ITP）是一种因血小板自身抗原免疫耐受性丢失，导致巨核细胞分化成熟障碍和血小板破坏增多的自身免疫性疾病[1]，近年来其发病率逐渐上升，约占临床出血性疾病的1/3[2]。目前ITP 的主要治疗药物及措施是肾上腺皮质激素、免疫抑制剂以及脾脏切除术等[3]，但存在药物依赖性及不良反应，容易形成难治性ITP[4]。中医药在治疗ITP 方面具有一定优势[5-7]，多种中药或复方对ITP具有较好的治疗效果[8-10]。

ITP 属于中医学的“紫癜”[11]范畴，主要病机为脏腑功能失调、气血运行紊乱，以出血为主要症候表现[12]。金粟兰科草珊瑚属植物肿节风具有活血化瘀、凉血止血的功效，可用于治疗紫癜[13]。本课题组前期研究[14]通过体外实验证明肿节风及其提取物具有促进血小板生成的作用。临床研究[15]发现，肿节风联合小剂量强的松治疗ITP 能更有效地提高血小板计数及T-淋巴细胞亚群水平，还可降低强的松引起的毒副作用。但肿节风治疗ITP 的药效物质仍不清晰，是限制其临床使用的主要原因之一。

传统药效物质基础研究通常采取先分离后筛选的方式，但无法从整体上体现中药“多成分、多靶点”的特性[16]。而近年来兴起的中药血清药物化学是一种对含药血清或血浆进行分析的研究方法，能直观反映中药被吸收入血的成分，在简化中药分析体系的同时能维持中药的整体性[17-19]。同时，采用不同时间点采集含药血浆的方式，能够全面体现中药成分在体内的动态变化过程[20]。因此，本研究拟首先采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（UHPLC-Q-TOF/MS）对肿节风总黄酮提取物经时含药血浆进行峰值提取；然后，以人巨核细胞白血病细胞（Dami）与人骨髓基质细胞（HS-5）共培养的方式建立巨核细胞分化障碍模型，并以此作为评价体系；最后，通过量效关系以偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）计算分析出主要效应成分，并通过回归评价体系验证其药效，以期阐明肿节风总黄酮提取物治疗ITP的主要效应成分。

1 材料与方法

1.1 细胞株人巨核细胞白血病细胞（Dami）、人骨髓基质细胞（HS-5），均购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 动物8周龄雄性SD 大鼠49只，SPF级，体质量（180±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。本动物实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会审批，批准文号：JZLLSC20220843。

1.3 药物及试剂佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA，批号：SLCL5743），美国Sigma公司；兔抗大鼠血小板血清（APS）以及肿节风总黄酮均为实验室前期制备[21]，肿节风总黄酮提取物以芦丁作为对照检测总黄酮含量为78.53%[22]。迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖（Ros，批号：wkq22082607）、胡萝卜苷（Dau，批号：wkq22082503），均购于四川维克奇生物科技有限公司； RPMI Medium 1640 培养基（批号：8121738），美国Gibco 公司；胎牛血清（批号：22010701），浙江天杭生物科技有限公司；CD41a-PE（批号：E14074-104）、CD61-FITC（批号：2301151）抗体，均购于美国eBioscience 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号：1209MO34），北京索莱宝生物科技公司。

1.4 主要仪器Waters Acquity UPLC 液相色谱系统、Q-TOF SYNAPT G2 HDMS 质谱仪，美国Waters 公司；SL8R 型台式冷冻离心机、SPD131DDA-P1-230型离心浓缩系统、Forma 3111 型恒温CO2培养箱，美国Thermo Fisher 科技公司；Moflo XDP 流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。

1.5 建立Dami＋HS-5 细胞共培养体系的巨核细胞分化成熟障碍模型分别取处于对数生长期的Dami细胞5×104个与HS-5 细胞2×105个；将HS-5 细胞混悬于2 mL 培养基并接种于Transwell 共培养板下层；将Dami细胞混悬于1 mL 培养基并接种于共培养板上层。利用终浓度为5 ng·mL-1的PMA 和体积分数为1%的APS 联合作用于共培养模型，药物在接种的同时混入下层培养基。实验分组：Dami 组（Dami）、对照组（Dami+HS-5）、PMA 组（Dami+HS-5+5 ng·mL-1PMA）、模型组（Dami+HS-5+1% APS+5 ng·mL-1PMA），接种后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h。

1.6 流式细胞术检测共培养细胞模型相关表面分子的表达水平“1.5”项下细胞模型建立48 h 后，将Dami 细胞收集至2 mL离心管，PBS离心清洗2次。用500 μL PBS 重悬细胞，再加入5 μL CD41a-PE、CD61-FITC 染液，混匀后室温下避光染色30 min。离心去除多余染液，重悬后使用200目细胞筛网进行过滤。采用Moflo XDP 流式细胞仪检测巨核细胞分化成熟表面标记分子CD41a、CD61 的表达情况。采用FlowJo vX软件对结果进行分析，实验重复3次。

1.7 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆的制备取49 只SD 雄性大鼠，随机分为空白血浆组、15 min组、30 min 组、60 min 组、90 min 组、120 min 组、240 min 组，每组7 只。给药前禁食不禁水12 h，各给药组大鼠灌胃肿节风总黄酮提取物1.26 g·kg-1，空白血浆组给予等剂量生理盐水灌胃。给药后，在6个设定时间点（15、30、60、90、120、240 min）采用戊巴比妥钠（20 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，进行腹主动脉取血；置于肝素钠抗凝试管中，室温下静置2 h；然后以4 ℃、2 800×g离心15 min；取上清液于56 ℃灭活30 min，0.22 μm 滤膜过滤除菌，-80 ℃保存、备用。

1.8 血浆样品前处理取100 μL 血浆样品，加入300 μL 甲醇，涡旋混匀30 s，4 ℃下恒温静置3 h后，以4 ℃、14 000×g离心15 min；取200 μL 上清液于离心管中，进行真空离心浓缩2 h；浓缩后加200 μL 水-甲醇溶液（水∶甲醇=85∶15）复溶，涡旋混匀30 s，再以相同条件离心15 min；取100 μL 上清液于进样小瓶，待测。

1.9 色谱条件色谱柱：Waters-UPLC-T3柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm），柱温：40 ℃，流动相为0.1%甲酸-水溶液（A）-乙腈（B）；采用梯度洗脱方式（洗脱条件：0～2 min，1% B；2～26 min，1%～99% B；26～28 min，99% B；28～30 min，99%～90% B；30～30.1 min，90%～1% B；30.1～32 min，1% B），正、负离子模式下相同；流速：0.1 mL·min-1；进样量：3 μL。

1.10 质谱条件电离源（ESI）温度：100 ℃；锥孔气流速：50 L·h-1；去溶剂气温度：400 ℃；流速：800 L·h-1。正、负离子模式下，毛细管电压分别为3.0、2.5 kV，锥孔电压为40 V，质量数采集范围：50～1 000 Da。为确保质量的准确性和重复性，采集过程通过亮氨酸脑啡肽进行实时质量校正。串联质谱碰撞气为氩气，低碰撞能：4 eV，高碰撞能：20～40 eV。为保证整个分析系统的稳定性，实验过程中使用质控（Quality control，QC）样品进行方法学验证，QC 样品由每个样品各取10 μL 混合而得，每检测6个样品后穿插采集1次QC样品。

1.11 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵（X 矩阵）的建立采用MassLynx V4.1 软件对样品进行数据信号采集，通过Progenesis QI 软件对所采集的数据进行峰提取处理，生成化合物统一候选列表。以空白血浆组所采集的信号变量为空值，其他组该变量（不为空值的变量）作为效应成分进行研究，并以m/z@保留时间（例如：373.722 5@11.32）表示变量化合物，以其峰面积构建量矩阵（X矩阵）。

1.12 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆效应矩阵（Y矩阵）的建立基于“1.5”项下所建立的巨核细胞分化成熟障碍模型，将所采集的6个不同时间点的肿节风总黄酮提取物经时含药血浆进行稀释后加药干预，设置对照组、PMA 组、模型组、空白血浆组、15 min 组、30 min 组、60 min 组、90 min 组、120 min 组以及240 min 组。按组别设置添加相应试剂以及经时含药血浆，其中经时含药血浆与空白血浆占比为15%；接种后置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养48 h；同“1.6”项下方法，采用流式细胞术检测细胞表面分子CD41a、CD61的表达水平。

1.13 数据采集与处理通过检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中国知网（https：//www.cnki.net）、Scifinder（https：//scifinder-n.cas.org）、Pubmed（https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov）、Web of Science（https：//www.webof⁃science.com）等数据库及相关文献，建立肿节风化学成分数据库。对X 矩阵和Y 矩阵数据进行标准化处理，导入SIMCA-P 软件进行PLS 建模。以变量重要性投影（Variable importance for projection，VIP）＞1为阈值，筛选与细胞表面分子CD41a、CD61 变化相关的效应成分。将VIP＞1 的效应成分通过Progen⁃esis QI 软件及自建肿节风化学成分数据库进行化学成分鉴定，作为肿节风总黄酮提取物中促进巨核细胞分化的潜在效应成分。

1.14 流式细胞术检测潜在效应成分对共培养模型中巨核细胞分化相关表面分子的影响将适量迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖（Ros）、胡萝卜苷（Dau）分别使用DMSO配制为母液，再用超纯水配至适合浓度。基于“1.5”项下所建立的巨核细胞分化成熟障碍模型，将ROS、Dau 分别按低、中、高剂量（40、60、80 μg·mL-1）分组干预；置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养48 h；同“1.6”项下方法，采用流式细胞术检测细胞表面分子CD41a、CD61的表达量。

1.15 统计学处理方法采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 共培养体系下巨核细胞分化成熟障碍模型表面标记分子CD41a、CD61 的表达情况结果见图1。与Dami 组比较，对照组Dami 细胞表面的CD41a 表达水平明显升高（P＜0.05）。与对照组比较，PMA 组Dami 细胞表面的CD41a、CD61 表达水平均显著升高（P＜0.01）。与PMA 组比较，模型组Dami 细胞表面的CD41a、CD61 表达水平均显著降低（P＜0.01）。结果表明，Dami、HS-5 两种细胞共培养能够模拟骨髓微环境以促进巨核细胞分化，并且在共培养模型的基础上利用PMA、APS 诱导可成功建立巨核细胞分化成熟障碍模型。

图1 PMA 及APS 对巨核细胞表面分子CD41a、CD61 表达的影响（±s，n=3）Figure 1 Effects of PMA and APS on the expression of surface molecules CD41a and CD61 in megakaryocytes（±s，n=3）

2.2 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵（X 矩阵）的建立通过峰面积反映肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中各化学成分的含量，总离子流图见图2。正、负离子模式下不同时间点的肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵（X矩阵）见表1、表2。

表1 正离子模式下肿节风总黄酮经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵（X 矩阵）Table 1 The time-dependent change matrix（X matrix）of chemical constituents in time-dependent plasma containing total flavonoids extracts of Sarcandra glabra in the positive ion mode

表2 负离子模式下肿节风总黄酮经时含药血浆中的化学成分随时间变化量矩阵（X 矩阵）Table 2 The time-dependent change matrix（X matrix）of chemical constituents in time-dependent plasma containing total flavonoids extracts of Sarcandra glabra in the negative ion mode

图2 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆总离子流图Figure 2 Total ion chromatogram of time-dependent plasma containing total flavonoids extracts of Sarcandra glabra

2.3 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆随时间变化效应矩阵（Y 矩阵）的建立结果见图3。巨核细胞分化成熟障碍模型细胞经肿节风总黄酮提取物经时含药血浆干预后，与空白血浆组比较，15、30、60、90、120、240 min 各时间点Dami 细胞表面分子CD41a、CD61 表达水平均显著升高（P＜0.01），且CD41a、CD61 均在30 min 组表达水平最高。结果表明，肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化成熟的作用会随着入血时间变化而波动，存在消长过程，并且在30 min的相关性最强。

图3 肿节风总黄酮提取物经时含药血浆对巨核细胞表面分子CD41a、CD61 表达的影响（±s，n=3）Figure 3 Effects of time-dependent plasma containing total flavonoids extracts of Sarcandra glabra on the expression of surface molecules CD41a and CD61 in megakaryocytes（±s，n=3）

2.4 X 矩阵与Y 矩阵数据的PLS 相关分析将X 矩阵和Y 矩阵数据进行标准化处理后，导入SIMCA-P软件进行PLS建模，得出正、负离子模式下肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中化学成分的VIP值，结果见图4。通过Progenesis QI 软件对VIP＞1 的信号采集数据进行处理，根据各化合物的保留时间及一、二级质谱碎片信息，结合HMDB 5.0 等在线数据库，参考相关文献和自建肿节风化学成分数据库，推测出可能的化合物。根据VIP值大小以及参考相关文献综合筛选，选取540.363 8@12.25 与559.299 1@11.53 两个成分进行药效学验证。其中，559.299 1@11.53 被鉴定为胡萝卜苷（Daucosterol，Dau），对应在正离子模式下[M+H-H2O]+加合形式值；540.363 8@12.25 被鉴定为迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖（Rosmarinic acid 4-O-β-D-glucoside，Ros），对应在正离子模式下[M+NH4]+加合形式值[23-25]。

图4 正、负离子模式下肿节风总黄酮提取物经时含药血浆中化学成分的VIP 值Figure 4 VIP value of chemical constituents of time-dependent plasma containing total flavonoids extracts of Sarcandra glabra under positive and negative ion modes

2.5 Dau、Ros 对巨核细胞表面分子CD41a、CD61表达的影响结果见图5。巨核细胞分化成熟障碍模型经Ros、Dau 分别干预后，与模型组比较，Ros 及Dau低、中、高剂量组Dami细胞表面的CD41a、CD61表达水平均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，Ros、Dau两种活性成分都能够有效促进巨核细胞分化。

图5 胡萝卜苷（Dau）、迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖（Ros）对巨核细胞表面分子CD41a、CD61 表达的影响（±s，n=3）Figure 5 Effects of Daucosterol（Dau）and Rosmarinic acid 4-O-β-D-glucoside（Ros）on the expression of surface molecules CD41a and CD61 in megakaryocytes（±s，n=3）

3 讨论

巨核细胞分化障碍是免疫性血小板减少症（ITP）的特征性改变，也是其发病和治疗的关键[26]。巨核细胞分化必须在特定的骨髓微环境中有序进行，而这个过程与微环境中的骨髓基质细胞密切相关。骨髓基质细胞是构成骨髓微环境网架结构的重要组成部分，能够支持、保护以及调节造血干细胞的增殖与分化[27]，在巨核细胞分化成血小板过程中发挥重要作用。过往关于ITP 的药效学研究中，巨核细胞分化障碍模型通常仅由单一细胞构成[28-29]，未能体现骨髓基质细胞及微环境对巨核细胞分化的影响[30]。因此，本研究采用骨髓基质细胞HS-5与巨核细胞Dami共培养以模拟体内骨髓微环境。结果显示，与Dami 细胞单独培养相比，HS-5+Dami 共培养体系中巨核细胞表面分子CD41a 的表达水平明显升高，说明骨髓基质细胞对巨核细胞分化有较强促进作用。由于抗血小板自身抗体与骨髓中巨核细胞结合能导致其分化成熟受阻[31]，故本研究通过在HS-5+Dami 共培养体系中添加含抗血小板抗体血清（APS）来建立体外巨核细胞分化障碍模型[32]。结果显示，与PMA 组比较，模型组共培养体系中巨核细胞表面分子CD41a、CD61的表达水平显著降低，表明成功构建了体外巨核细胞分化障碍模型。该模型可为巨核细胞分化障碍相关药效学研究及效应成分筛选提供更加合理的评价体系。

中药效应成分筛选一直是中药研究的关键步骤，然而传统的中药效应成分研究多采用先化学分离后药理验证的模式，存在耗时长、工作量巨大、效率低的缺陷，也未能关注中药效应成分在体内的动态变化过程，该筛选方式亟待优化升级[33]。本研究采用经时含药血浆的方式代替以往中药提取物进行化学成分分析，能够体现中药成分在血液中随时间的移行变化。利用UHPLC-Q-TOF/MS 技术将不同时间点动态变化的肿节风总黄酮提取物各入血成分的“量”与其促巨核细胞分化的“效”进行关联，并通过PLS 模型进行量效关系分析，对效应成分进行VIP值计算。VIP 值＞1 可认为相应成分对模型有显著贡献，可以作为潜在效应成分进行化学成分鉴定。最后，将潜在效应成分中VIP 值最高的Dau 以及为验证自建数据库准确性而选择的Ros作用于巨核细胞分化障碍模型，验证实验结果表明两种化学成分都能显著促进巨核细胞的分化，初步揭示了肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。但相关效应成分对共培养体系中巨核细胞和基质细胞的影响及具体分子机制还有待深入探索。

综上所述，本研究建立了Dami与HS-5共培养的巨核细胞分化障碍模型，采用UHPLC-Q-TOF/MS 技术对肿节风总黄酮提取物经时含药血浆进行分析，通过PLS模型进行量效关系分析，筛选得到与细胞表面分子CD41a、CD61 变化相关的迷迭香酸-4-O-β-D-葡萄糖（Ros）与胡萝卜苷（Dau），其可能为肿节风总黄酮提取物促进巨核细胞分化的效应成分。