珠子参对慢性咽炎模型大鼠的干预作用及其急性毒性研究

何旭东，周连丽，杨岚焜，陶语萱，刘志博，王文博，孙思琪，俞捷，杨兴鑫（云南中医药大学中药学院，云南 昆明 650500）

咽炎是一种高度流行的上呼吸道炎症性疾病，严重影响患者生活质量，其临床表现为咽喉瘙痒、干燥、酸痛、咳嗽以及异物或喉部阻塞[1]。目前，慢性咽炎的临床治疗药物主要有糖皮质激素、抗生素和非甾体类抗炎药[2]。然而，长期使用这些药物治疗慢性咽炎可能会引起胃黏膜、肝脏或肾脏损伤等副作用。

中药具有疗效确切，毒副作用小，多成分、多靶点综合作用的特点，是药物挖掘的重要途径，可从中药中挖掘安全有效的缓解慢性咽炎的药物。复方利咽口服液、蓝芩口服液、咽炎消合剂等经典复方，以及铁皮石斛、山豆根、荔枝草等单味中药均具有良好的慢性咽炎缓解作用[3]。

珠子参（Panacis Majoris Rhizoma）为五加科植物珠子参PanuxjaponicusC.A.Mey.var.major（Burk.）C.Y.Wu et K.M.Feng 或羽叶三七PanaxjaponicusC.A.Mey.var.bipinnatifidus（Seem.）C.Y.Wu et K.M.Feng 的干燥根茎。其性苦、味甘，微寒，归肝、肺、胃经，具有补肺养阴，祛瘀止痛，止血之功效。用于气阴两虚，烦热口渴，虚劳咳嗽，关节痹痛，咳血，吐血，衄血，崩漏，外伤出血等症，也是很多民间配方用于跌打损伤、外伤出血、胃痛、咽喉肿痛等症状不可缺少的中药材，具有重要的利用价值[4]。

珠子参常被白族、藏族、傈僳族等少数民族用于缓解咽喉肿痛、咽喉炎和颌下腺炎等症状，其中治疗咽喉肿痛被视为其主要疗效之一[5]。现代药理学研究[6-8]表明，珠子参具有良好的抗非酒精性脂肪性肝炎及耳廓炎症等活性。目前尚未见珠子参缓解慢性咽炎相关药理作用的科学内涵及其提取物的毒性作用的报道。因此，本实验拟采用乙型溶血性链球菌诱导的慢性咽炎大鼠模型，以探究其药理作用并开展安全性评估，为寻找用于慢性咽炎防治的创新中药以及珠子参资源的创新开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物SD 大鼠，雄性，SPF 级，体质量200～220 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，动物质量合格证号：430727220100259017；昆明小鼠，雌雄各半，SPF 级，体质量18～20 g，北京斯贝福生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010，动物质量合格证号：110324230101967557；动物实验饲料购自双欣生物科技有限公司，饲料生产许可证号：SCXK（京）2020-0010，饲养环境为温度18～22 ℃、湿度50%～60%、12 h 交替照明。动物实验经云南中医药大学动物实验中心伦理委员会审查批准，批准号：R-062022121。

1.2 药物及试剂珠子参购自云南鸿翔生物科技有限公司（批号：20210323），经云南中医药大学杨兴鑫教授鉴定为正品，存放于云南中医药大学中医药防治代谢性疾病重点实验室。甘油三酯（Triglyceride，TG；货号：A110-1-1）、总胆固醇（Total cholesterol，TC；货号：A111-1-1）、丙氨酸转氨酶（Alanine transaminase，ALT；货号：C009-2-1）、天冬氨酸转氨酶（Aspartate transaminase，AST；货号：C010-2-1）、白蛋白（Albumin，ALB；货号：A028-2-1）、葡萄糖（Glucose，GLU；货号：F006-1-1）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN；货号：C013-2-1）检测试剂盒，南京建成生物医学工程研究所；白细胞介素6（Interlukin-6，IL-6；批号：220426032R），白细胞介素1β（Interlukin-1β，IL-1β；批号：220426076R）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor，TNF-α；批号：220426081R）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2；批号：220426075R）、单核细胞趋化蛋白1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1；批号：220426024R）、细胞间黏附分子1（Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1；批号：220426068R）、C 反应蛋白（C - reactive protein，CRP； 批号：220426053R）、环氧合酶2（Epoxygenase 2，COX-2；批号：220426047R）检测试剂盒，江苏酶联生物技术有限公司；乙型溶血性链球菌，中国食品药品检定研究院，批号：32210-5a1；肠产毒素培养基，索莱宝生物科技有限公司，批号：HB4120；无水乙醇（货号：100092683）、二甲苯（货号：10023418）、中性树胶（货号：10004160），国药集团化学试剂有限公司；环保型脱蜡液（货号：G1128）、通用型组织固定液（货号：G1101）、HE 染液套装（货号：G1003），武汉赛维尔生物科技有限公司；戊巴比妥钠，德国默克公司，批号：P3761。

1.3 仪器SQP 电子分析天平，德国Sartorius 公司；MILLI-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司；DK-S24电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；FMB-40 全自动雪花制冰机，上海比朗仪器制造有限公司；EXF24086V 超低温冰箱，赛默飞世尔科技有限公司；SB-4200 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；HR/16M 高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；pectraMax®Plus384 光吸收酶标仪，美国Molecular Devices 公司；N-11000-WD 旋转蒸发器，上海爱朗仪器有限公司；FD5-3型冷冻干燥机，美国金西盟国际集团；XS-900i全自动血液分析仪，华鑫科技有限公司；RM2016 病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；Donatello 脱水机，意大利DIAPATH 公司；JB-P5 包埋机，武汉俊杰电子有限公司；JB-L5 冻台，武汉俊杰电子有限公司；KD-P组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；CRYOSTAR NX50 冰冻切片机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；NIKON ECLIPSE E100 正置光学显微镜、NIKON DS-U3成像系统，日本尼康公司。

1.4 药物制备珠子参药材烘干，粉碎，加12 倍蒸馏水浸泡12 h，煎煮90 min（以煮沸时开始计算），收集滤液；残渣再加蒸馏水煎煮60 min，收集滤液；合并二次滤液。滤液减压浓缩至浸膏状，转移至冻干机中，冷冻干燥得冻干粉，至干燥器中保存备用，临用时用生理盐水配制溶液。

1.5 珠子参急性毒性研究

1.5.1 分组及给药方法 取20只昆明小鼠，在适应性饲养1周后，随机分为两组，分别为对照组、珠子参给药组（生药量为74.4 g·kg-1，约为人临床用量的347.2 倍），每组10 只，雌雄各半。实验前小鼠禁食不禁水12 h，给药组经口给予单次最大剂量32 g·kg-1珠子参提取物灌胃，对照组给予等量的生理盐水，灌胃3 h后自由进食。

1.5.2 样本采集 给药后每天测量并记录体质量，每天观察1 次一般行为、临床体征和死亡率，连续观察14 d。实验结束后，用1%戊巴比妥钠按50 mg·kg-1腹腔注射麻醉小鼠。从眼眶采集血液，一部分血样用于血常规分析；另一部分血样于4 ℃、以3 500 r·min-1的速度（离心半径8 cm）离心15 min，获得血浆用于血生化分析。并收集动物的脾、肝、肾、肺和心脏样本，在生理盐水冲洗后，将其固定在4%多聚甲醛溶液中室温保存24 h。

1.5.3 血常规及血生化检测 全自动血液分析仪检测血常规，包括白细胞数（White blood cell，WBC）、红细胞数（Red blood cell，RBC）、血红蛋白浓度（Hemoglobin，HGB）、 红细胞压积（Hematocrit，HCT）、血小板（Platelet，PLT）检测。此外，按照试剂盒说明书在酶标仪上检测血生化指标，包括TG、TC、ALT、AST、BUN、ALB、GLU水平。

1.5.4 心、肝、脾、肺、肾组织HE 染色 取出样本，使用乙醇逐级脱水，经过二甲苯透明化处理，浸泡在石蜡中进行包埋，并进行均匀切片。切片烘干后进行脱蜡及乙醇化处理。然后，将切片浸泡在苏木精染色溶液中3～5 min，进行自来水洗涤，使用分化液进行分化处理直至返蓝。然后，将切片在乙醇中脱水处理5 min，浸泡在伊红染液中染色5 min，经逐级乙醇脱水及二甲苯透明化处理，最后使用中性树胶封片。通过显微镜进行镜检，并进行图像采集和分析。

1.6 珠子参干预慢性咽炎的药效研究

1.6.1 分组及给药 36只雄性SD 大鼠按每组6只随机分为6 组，分别为对照组、模型组、阳性对照（醋酸泼尼松片）组以及珠子参提取物低、中、高剂量组。珠子参提取物低、中、高剂量组，每天分别灌胃0.58、1.16、2.32 g·kg-1的珠子参提取物，分别相当于成人用量的6.3、12.6、25.2倍；剂量设置参考等效剂量系数折算法[9]，即按单位体质量的剂量计算，大鼠等效剂量相当于人剂量（0.214 g·kg-1）的6.3 倍，珠子参提取率为43%，故大鼠等效给药剂量为0.58 g·kg-1。阳性药组每天灌胃6.25 mg·kg-1的醋酸泼尼松片药液。对照组、模型组，每天均灌胃等体积蒸馏水，灌胃体积为5 mL·kg-1。每日1次，定时灌胃，持续30 d。

1.6.2 慢性咽炎模型复制 参考有关文献研究[10]复制乙型溶血性链球菌诱导的大鼠慢性咽炎模型。预防性给药15 d后，除空白对照组以外，其余5组按如下方法复制病理模型：用灭菌镊子翻开大鼠上颌口颊，用注射器近水平方向点刺黏膜，注射含乙型溶血性链球菌为108CFU·mL-1的菌液，每只大鼠注射0.02 mL，每3 d 注射1 次，共5 次，造模期间持续给药。通过观察动物在造模后出现的症状、体征以及咽部病理形态学的改变，评估造模的成功与否。成功的造模表现为动物出现精神状态欠佳、频繁饮水、毛色不光泽等症状，并且观察到动物死亡现象，以及咽部红肿且伴有少量黄色分泌物的病理变化。

1.6.3 样本采集 末次给药后，禁食不禁水12 h，用1%戊巴比妥钠溶液按40 mg·kg-1经腹腔注射麻醉SD大鼠。腹主动脉取血，室温放置1 h，以离心半径8 cm、3 000 r·min-1离心15 min，分离血清；从环状软骨水平切断食管、气管，自咽后壁向上分离软组织至颚帆，水平切断软组织，摘取咽部组织及黏膜下组织放入预先准备好的4%多聚甲醛溶液固定，常温保存24 h。

1.6.4 血清指标检测 取大鼠血清，参照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书方法检测血清中IL-6、ICAM-1、IL-β、MCP-1、TNF-α、CRP、COX-2、PGE2水平。1.6.5 咽组织HE染色 方法同“1.5.4”项下。

1.7 统计学处理方法采用SPSS 21.0 统计软件分析处理数据，各组数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验。P＜0.05时，认为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 珠子参安全性评估给予珠子参提取物后，小鼠状态正常，在14 d 观察期内，所有小鼠全部存活，未表现出明显异常。如图1所示，与对照组比较，珠子参提取物的干预对小鼠体质量的增加没有明显影响，且对肝、肺、肾、心系数也无明显影响（P＞0.05），但脾系数明显增加（P＜0.01）。如图2 所示，与对照组比较，珠子参提取物干预后，血液中WBC、RBC、HGB、HCT 和PLT 以及血浆中的TG、TC、AST、ALB、BUN、GLU 水平均未有明显改变，但明显升高血浆中ALT 水平（P＜0.05）。如图3 所示，与正常组比较，珠子参处理后，心、肝、肺、肾细胞的形态和大小无明显差异；但脾脏有明显病理改变，主要见于白髓面积明显增大，白髓内有大量淋巴细胞增殖，红髓面积明显减少。结果表明，珠子参提取物可能对脾存在潜在毒性，但没有导致小鼠死亡。

图1 珠子参对小鼠体质量与脏器系数的影响（±s，n=10）Figure 1 Effects of Panacis Majoris Rhizoma on body mass and organ index in mice（±s，n=10）

图2 珠子参对小鼠第14 天血常规及血浆生化水平的影响（±s，n=10）Figure 2 Effects of Panacis Majoris Rhizoma on blood routine and plasma biochemistry in mice on the day 14（±s，n=10）

图3 珠子参对小鼠第14 天脾、肝、肺、肾和心脏组织形态学的影响（HE 染色，×20）Figure 3 Effects of Panacis Majons Rhizoma on histomorphology of spleen，liver，lung，kidney，and heart in mice on the day 14（HE staining，×20）

2.2 珠子参对慢性咽炎大鼠的干预作用与对照组比较，模型组大鼠在造模期间，显示出了一些症状，包括饮水量增加、进食量减少、精神状态差以及毛色不光泽。如图4所示，与对照组比较，乙型溶血性链球菌诱导后，大鼠血清中IL-6、ICAM-1、IL-1β、MCP-1、TNF-α、CRP、COX-2、PGE2 水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.001）；如图5所示，与对照组比较，乙型溶血性链球菌明显诱导大鼠咽组织黏膜层鳞状上皮增生，黏膜上皮增厚，固有层腺体坏死，炎性细胞浸润，表明乙型溶血性链球菌成功诱导了大鼠慢性咽炎疾病模型。在给予珠子参提取物干预后，与模型组比较，珠子参提取物高剂量组可明显逆转IL-6、MCP-1、CRP、COX-2指标的升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），有降低ICAM-1、IL-1β、TNF-α、PGE2 炎症因子水平的趋势（P＞0.05）；珠子参提取物中剂量组可明显逆转IL-6、ICAM-1、IL-1β、MCP-1、CRP、COX-2、PGE2 指标的升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），有降低TNF-α 炎症因子水平的趋势（P＞0.05）；珠子参提取物低剂量组可明显逆转IL-6、IL-1β、MCP-1、CRP、COX-2、PGE2 和TNF-α 指标的升高（P＜0.01，P＜0.001），有降低ICAM-1 炎症因子水平的趋势（P＞0.05）。此外，图5 显示珠子参提取物处理后，咽组织病理改变均有明显减轻。结果表明，珠子参提取物可抑制乙型溶血性链球菌导致的炎症反应从而缓解大鼠慢性咽炎，并有效逆转乙型溶血性链球菌引发的咽组织病理学改变。

图4 珠子参对慢性咽炎大鼠血清炎症因子的影响（±s，n=6）Figure 4 Effects of Panacis Majoris Rhizoma on serum inflammatory factors in rats with chronic pharyngitis（±s，n=6）

图5 珠子参对慢性咽炎大鼠咽部黏膜组织形态学的影响（HE 染色，×100）Figure 5 Effects of Panacis Majoris Rhizoma on the histomorphology of pharyngeal mucosa in rats（HE staining，×100）

3 讨论

慢性咽炎多见于成人，其病因复杂，症状顽固，病程长，症状易反复发作，治愈难度大。珠子参作为名贵中药材，其在民间被广泛应用于咽喉肿痛、咽喉炎等治疗，取得了良好的临床疗效[5]，但其发挥抗慢性咽炎药理作用的科学内涵及其安全性未见报道。本研究采用单次灌胃最大剂量珠子参以评价珠子参的安全性，结果发现，在74.4 g·kg-1生药量下，小鼠体质量及生长状况无明显差异，且无致死致伤的情况出现，血液WBC、RBC、HGB、HCT、PLT 水平和血浆TG、TC、AST、ALB、TP、BUN 水平差异均无统计学意义，但会明显升高血浆ALT 水平；此外，除小鼠脾指数明显升高，其它脏器指数未见明显病理变化；心、肝、肺、肾细胞形态和大小无明显变化，但脾白髓面积明显增加，红髓面积明显减少。结果提示，在相当于成人用量的347.2 倍生药量下，珠子参可能对脾脏有潜在毒性，但不会导致小鼠死亡，表明珠子参口服安全性较高，其临床用量安全可靠；且本研究中珠子参提取物高剂量组2.32 g·kg-1的给药剂量（生药量为5.40 g·kg-1，相当于成人用量的25.2倍）是安全有效剂量。

进一步评价珠子参对乙型溶血性链球菌诱导的慢性咽炎大鼠的干预作用。结果发现，珠子参能明显降低大鼠血清IL-6、COX-2、IL-1β、ICAM-1、CRP、TNF-α、MCP-1 和PGE2 水平，此外还有效逆转了乙型溶血性链球菌诱导的咽部组织形态学病变，降低了咽部组织炎症细胞浸润。结果表明珠子参具有良好的抗炎作用。贺海波等[11]的研究也发现珠子参可抑制二甲苯所致小鼠耳廓的肿胀度结果，具有抗炎作用。此外，也有研究[12]表明珠子参总皂苷IVa能阻断NF-κB 的活化，缓解脂多糖对肝脏造成的损伤而保护肝脏。因此，本研究组推测珠子参进入体内后，能减缓细菌体内扩散，促进炎症渗出物的吸收，抑制毛细血管通透性增加，有效改善细胞组织重建，这可能与NF-κB信号通路的调控有关。

然而，仍有一些方面值得深入开展研究，如本研究采用一种致病菌诱导慢性咽炎模型，而生活中慢性咽炎往往是多种细菌感染所致，因此有必要建立多种细菌诱导的慢性咽炎模型以评价珠子参药效；本课题仅研究证实珠子参可通过抑制炎症反应并改善咽喉黏膜病理变化而有效缓解慢性咽炎，有必要深入研究其调节的具体信号通路及药效物质基础。

综上所述，本研究首次采用整体动物实验证实了珠子参提取物可通过抑制炎症反应缓解乙型溶血性链球菌诱导的慢性咽炎，但其对脾脏可能存在潜在毒性作用。