基于网络药理学及分子对接探讨四逆散对溃疡性结肠炎与抑郁症“异病同治”的作用机制

单佳铃，胡伟琼，谢勤，白薇，胡田彧，吕燕妮，江明金（.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 0006；.复旦大学附属肿瘤医院闵行分院，上海 0040；.江西省肿瘤医院，江西 南昌 009）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种累及结直肠的慢性非特异性炎症性疾病，因反复发作，导致患者大多伴有抑郁焦虑症状，而抑郁焦虑又会促进疾病的复发，如此恶性循环是其难以治愈的关键原因之一[1]。抑郁症是一种慢性复发性情感障碍类疾病，患者常伴有食欲减退、便秘、腹胀、腹泻等胃肠道症状，而胃肠道不适又会加重患者的抑郁焦虑情绪[2]。溃疡性结肠炎和抑郁症都具有病因复杂、病证多样化、病程迁延等发病特点，且研究[3]显示两种疾病之间可能存在双向影响。

四逆散出自《伤寒论》，由柴胡、白芍、枳实、甘草4味中药组成，被誉为疏肝解郁之祖方[4]，具有透邪解郁、疏肝理脾之功效，主治阳郁厥逆证及肝脾气郁证。方中柴胡疏肝解郁、透邪外出，为君药；白芍敛阴养血为臣药，与柴胡一敛一散；佐以枳实理气解郁、泄热除痞，与柴胡一升一降；使以甘草调和诸药，防止柴胡过度疏散，枳实过度降泄。现代临床多将四逆散用于治疗消化及神经精神系统疾病，如胃炎、胃溃疡、溃疡性结肠炎、慢性肝炎、抑郁症等[5]。研究显示，四逆散对溃疡性结肠炎[6-7]、抑郁症[8-9]及溃疡性结肠炎合并抑郁症[10]患者均具有较好的治疗作用。但四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的活性成分及作用机制尚不清楚，故本研究拟基于网络药理学方法及分子对接技术探讨其可能的活性成分、作用靶点和通路，以期揭示其潜在作用机制，为后续深入的实验研究提供参考。

1 方法

1.1 四逆散活性成分及其作用靶点筛选运用中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分别以“柴胡”“白芍”“枳实”“甘草”为检索词，并参考相关研究[11]设置口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%、 类药性（Drug likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，检索获得四逆散的潜在活性成分及其相关作用靶点。利用全球蛋白资源数据库（UniProt，https：//www.uniprot.org）将得到的靶点预测结果进行蛋白名与基因名转换，并限定物种来源为人，将靶点预测结果标准化，最后删除重复项，获得四逆散活性成分作用靶点。

1.2 疾病相关靶点预测借助人类基因数据库（GeneCards，https：//www.genecards.org/）、比较毒物基因组学数据库（CTD，http：//ctdbase.org/）及治疗靶点数据库（TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/），分别以“Ulcerative colitis”“Depression”为检索词，检索溃疡性结肠炎和抑郁症的疾病相关靶点，将3个数据库所得靶点进行合并，删除重复项后获得2种疾病的相关靶点。

1.3 “中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络及共有靶蛋白互作网络构建对上述预测得到的四逆散活性成分作用靶点与溃疡性结肠炎及抑郁症的疾病相关靶点取交集，获得四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的潜在作用靶点（共有靶点）。分别将四逆散所含中药、活性成分、疾病及共有靶点导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络，分析核心成分。

为了明确共有靶蛋白间的相互作用关系，将共有靶点导入蛋白相互作用数据库（STRING 11.5，https：//STRING-db.org），构建共有靶蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）网络，限定物种来源为人，最低作用阈值设置为0.900，其余参数保持默认设置。将PPI网络关系导入Cytoscape 3.7.2软件，运用Network Analysis 插件功能进行分析，并依据拓扑参数节点度和中介中心度评价共有靶点，确定可能的关键靶点。

1.4 共有靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析使用生物学信息注释及可视化数据库（DAVID，http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对共有靶点进行基因本体（GO）、京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。以P＜0.05对结果进行筛选，获得四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）以及信号通路。

1.5 核心成分与关键靶点的分子对接验证选取“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络中节点度值排前5 位的活性成分（核心成分）与PPI 网络中节点度值和中介中心度值排前5 位的靶蛋白（关键靶点）进行分子对接验证。分别利用有机小分子生物活性数据库（PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）和蛋白质数据库（PDB，http：//www.rcsb.org）下载化合物的2D 结构（sdf 格式）及靶蛋白的3D 结构，并将其导入Discovery studio 2016 版软件中，利用Libdock 模块进行分子对接。结合能小于0说明受体和配体能够自发结合，参考相关研究[11]以结合能≤-5.0 kcal·mol-1作为其相互作用活性筛选的依据。

2 结果

2.1 四逆散的活性成分及其作用靶点利用TCMSP数据库检索并根据OB≥30%、DL≥0.18 筛选、去重后得到四逆散的活性成分136 个，其中17 个来自柴胡，13 个来自白芍，22 个来自枳实，92 个来自甘草。山柰酚为柴胡、白芍和甘草的共有成分，异鼠李素、槲皮素为柴胡和甘草的共有成分，白桦脂胺、谷甾醇为白芍和甘草的共有成分，柚皮素为枳实和甘草的共有成分。筛选去除19 个未匹配到相关靶点的成分，共得到潜在活性成分117个，匹配得到相关作用靶点267 个，利用UniProt 数据库校正并去重后得到作用靶点222个。

2.2 溃疡性结肠炎及抑郁症的疾病相关靶点利用GeneCards、CTD 及TTD 数据库检索，去重后得到溃疡性结肠炎疾病相关靶点17 134 个，抑郁症疾病相关靶点38 345个。

2.3 “中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络的构建与分析对四逆散活性成分作用靶点与溃疡性结肠炎及抑郁症的疾病相关靶点取交集，获得四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的潜在作用靶点（共有靶点）220个，见图1。

图1 四逆散治疗溃疡性结肠炎与抑郁症的“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络Figure 1 “Chinese medicinals-active components-diseases-common targets” network of Sini San Formula in the treatment of ulcerative colitis and depression

通过Cytoscape 3.7.2 软件绘制“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络（见图1），该网络共有343个节点（4 味中药，117 个活性成分，2 种疾病，220 个共有靶点）、2 085条边。在117个活性成分中，节点度值排前20 位的活性成分包括槲皮素（Quercetin）、山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、柚皮素（Naringenin）、7-甲氧基-2-甲基异黄酮（7-methoxy-2-methyl isoflavone）等，见表1。通过分析发现，四逆散的每个活性成分通常有多个靶点，多数靶点通常对应多个成分，说明四逆散治疗溃疡性结肠炎及抑郁症是通过多成分、多靶点协同发挥作用。其中，槲皮素为拥有最多靶点的活性成分，共有122 个靶点。

表1 “中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络中节点度值排前20 位的活性成分Table 1 Top 20 active components with node degree ranking in “Chinese medicinals-active components-diseases-common targets” network

2.4 共有靶点PPI 网络的构建与分析将共有靶点导入STRING 数据库构建PPI 网络，结果见图2。该PPI网络共有220 个节点、759 条边。其中，线条的粗细代表了靶点作用的强弱，颜色越深、圆圈越大的靶点为节点度值越高的靶点，连线越粗、颜色越深表示2 个靶点间的相关性越强。将PPI 网络关系导入Cytoscape 3.7.2 软件，分析筛选得到节点度值和中介中心度值排前20 位的靶点，包括激活子蛋白c-Jun（v-jun avian sarcoma virus 17 oncogene homolog，JUN）、丝裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、信号转导子和转录激活子3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、AKT 丝氨酸/苏氨酸激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、丝裂原活化蛋白激酶1（Mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）等，见表2。

表2 PPI 网络中节点度值及中介中心度值排前20 位的共有靶点Table 2 Top 20 common targets with node degree and betweenness centrality ranking in PPI network

图2 四逆散治疗溃疡性结肠炎与抑郁症的共有靶点PPI 网络Figure 2 PPI network for common targets of Sini San Formula in the treatment of ulcerative colitis and depression

2.5 共有靶点的GO 功能及KEGG 通路富集分析通过对220 个共有靶点进行GO 功能及KEGG 富集分析，得到657 个生物过程、70 个细胞组分、147 个分子功能以及133 条信号通路。分别取前10 个条目进行可视化，结果见图3、图4。GO 功能富集分析结果显示，生物过程主要与对药物的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、老化、对乙醇与脂多糖的反应、转录的正调控及DNA 模板化等有关；分子功能主要与酶结合、蛋白质与相同蛋白质结合、RNA 聚合酶II 转录因子活性及蛋白质异二聚化活性等有关；细胞组分主要存在于细胞外间隙、胞质溶胶、膜筏或核质中。KEGG 通路富集分析结果显示，共有靶点主要涉及TNF、IL-17、HIF-1、Toll样受体、Th17细胞分化、C 型凝集素受体、糖尿病并发症中的AGERAGE、人类巨细胞病毒感染及多种癌症（膀胱癌、前列腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌）等信号通路。

图3 四逆散治疗溃疡性结肠炎与抑郁症的共同靶点的GO 功能富集分析Figure 3 Enriched gene ontology terms of common targets of Sini San Formula in the treatment of ulcerative colitis and depression

图4 四逆散治疗溃疡性结肠炎与抑郁症的共同靶点的KEGG 通路富集分析Figure 4 Enrichment analysis of KEGG metabolic pathway of common targets of Sini San Formula in the treatment of ulcerative colitis and depression

2.6 分子对接验证将“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络中节点度值排前5 位的核心活性化合物（槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮）与PPI 网络中节点度值及中介中心度值排前5 位的关键靶蛋白（JUN、MAPK3、STAT3、AKT1、MAPK1）进行分子对接，验证其相互作用的活性，结果见表3。结果显示，5 个关键靶点蛋白均能与槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素对接成功，同时MAPK1、AKT1 能与7-甲氧基-2-甲基异黄酮对接成功，且结合能均小于-5 kcal·mol-1，提示槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素可能通过作用于上述5个关键靶点发挥其治疗溃疡性结肠炎及抑郁症的作用。

表3 四逆散治疗溃疡性结肠炎及抑郁症的核心活性成分与关键靶点的分子对接Table 3 Molecular docking between core active components and key targets of Sini San Formula in the treatment of ulcerative colitis and depression

3 讨论

“异病同治”是中医的重要治疗原则之一，又称为“异病同证同治”，是指不同病证在发展过程中出现了相同的病机变化或相同的证候表现时，可以采用相同的方法进行治疗。溃疡性结肠炎可归属于中医学的“大瘕泄”“肠澼”“赤沃”等范畴，胃肠失调，脾失健运，气机升降失常，可导致情志不畅，引发抑郁焦虑。抑郁症属于中医学的“郁证”范畴，忧思郁结，肝气不舒，横逆犯脾，脾失健运，胃肠失调，可引发溃疡性结肠炎。两种疾病在发生发展过程中具有潜移默化的关联性与因果关系，病机根本在于脾失健运，气机升降失调，病变脏腑皆与脾、肝、肺、大肠密切相关。四逆散有疏肝理脾和透邪解郁之效，暗合“升降”之理，是调和肝脾，调畅气机之妙方，因而符合溃疡性结肠炎和抑郁症“异病同治”之理。

本研究根据“中药-活性成分-疾病-共有靶点”网络中的节点度值从四逆散中筛选得到5个潜在的核心活性成分：槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、7-甲氧基-2-甲基异黄酮。其中槲皮素、山柰酚为黄酮醇类化合物，木犀草素为黄酮类化合物，柚皮素为二氢黄酮类化合物，7-甲氧基-2-甲基异黄酮为异黄酮类化合物。槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素均具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等多种药理作用，对溃疡性结肠炎和抑郁症均有治疗作用，可能是四逆散对溃疡性结肠炎和抑郁症“异病同治”的重要物质基础。研究发现，槲皮素能抑制溃疡性结肠炎小鼠类器官的炎症反应[12]，并可减轻慢性不可预见性轻度应激诱导的小鼠抑郁样行为[13]。山柰酚能减轻葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠的炎症反应[14]，并可通过抑制自噬和氧化应激减轻抑郁症大鼠海马神经元的损伤[15]。木犀草素可通过抑制STAT3 信号通路促进肠上皮细胞屏障功能，减轻溃疡性结肠炎小鼠的症状[16]，还可显著抑制溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应，改善结肠组织病理损伤[17]，并且可以减少创伤后应激障碍大鼠的恐惧、焦虑和抑郁[18]。柚皮素对醋酸诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有保护作用[19]，并且可通过抑制氧化炎症介质和NF-κB/BDNF 表达，改善反复低氧应激小鼠的抑郁及焦虑样行为[20]。

进一步根据共有靶点PPI 网络中的节点度值和中介中心度值筛选得到5 个潜在的关键靶点：JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、AKT1。上述关键靶点均能通过细胞因子、生长因子、应激等刺激激活，在细胞增殖、分化和凋亡等方面具有重要的调节作用。作为重要的转录因子之一，JUN主要参与调控免疫和炎症反应相关基因表达，诱骗寡核苷酸靶向JUN（即AP-1）可减轻实验性结肠炎小鼠的肠道炎症[21]。JUN及AKT1 可调节抗抑郁药物的功能，促进突触可塑性形成和神经传递[22-23]。丝裂原活化蛋白激酶MAPK3（即ERK1）和MAPK1（即ERK2）参与了溃疡性结肠炎的炎症反应[24]，并在人及抑郁症模型动物的前额叶皮层及海马组织中显著下调[25]。STAT3是介导IL-6调控溃疡性结肠炎[26]和抑郁样行为[27]的重要分子。上述研究表明，JUN、MAPK3、STAT3、MAPK1、AKT1 在溃疡性结肠炎或抑郁症的发病机制及治疗中均发挥了重要作用。将5 个潜在核心活性成分与5 个潜在关键靶点进行分子对接，验证其相互作用关系，结果显示5 个潜在关键靶点均与槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素有较强的结合活性。结果表明，槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素可能是四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的共有核心活性成分。

通过GO 功能和KEGG 通路富集分析发现，四逆散抗溃疡性结肠炎和抑郁症的作用机制可能与TNF、IL-17、Th17 细胞分化、HIF-1、Toll 样受体等信号通路有关。已有研究表明，左金丸合四逆散对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎患者具有较好的治疗作用，能够降低患者血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平[28]，下调HIF-1α、YKL-40、MMP-1 表达，减轻炎症反应，保护肠黏膜[29]。还有研究显示，Th17 细胞分化与溃疡性结肠炎和抑郁症有着密切联系，Th17 细胞作为促炎细胞，能够分泌促炎因子IL-17，提高血清IL-17水平，从而加重结肠黏膜的炎症反应[30]；抑郁症患者血清中的Th17 细胞百分比及Th17/Treg 水平较健康人群升高[31]；在反复发作的抑郁症患者中，Th17 免疫调节相关的炎性细胞因子失衡现象更为明显[32]。TLR4 作为Toll 样受体家族成员之一，参与了溃疡性结肠炎及抑郁症的发生发展。研究表明，溃疡性结肠炎小鼠较正常小鼠结肠组织中的TLR4 及NF-κB p65 表达显著上调[33]；抑郁症患者外周血单核细胞中的TLR4 表达水平与抑郁症状呈正相关[34]。此外，本研究还发现四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症的机制可能与某些癌症信号通路相关。

综上所述，本研究通过网络药理学方法初步探讨了四逆散对溃疡性结肠炎和抑郁症“异病同治”的机制，结果表明四逆散可能是通过槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素等活性成分，作用于JUN、MAPK3、STAT3、AKT1、MAPK1 等关键靶点，通过TNF、IL-17、HIF-1、Toll样受体、Th17 细胞分化等信号通路发挥治疗作用。本研究体现了四逆散治疗溃疡性结肠炎和抑郁症具有多成分、多靶点、多通路的作用特点，可为进一步研究其作用机制提供参考，但相关结果仍有待体内外实验验证。