利勃隆促进雄性少精症斑马鱼性行为和性腺发育及精子数量产生

赵成瑞,郑新越,常明亮,康志云

(1.山西医科大学汾阳学院,山西汾阳 032200;2.北京第一生物化学药业有限公司,北京 101400)

全球约50%不孕不育由男性不育引起[1-3],男性不育目前已成为全球社会性疾病。研究报道,男性精液质量和浓度均呈下降趋势,少、弱精症占男性不育症的75%[4-7]。目前针对少、弱精子症,临床多用雌激素受体阻滞剂(如枸橼酸氯米芬)进行治疗,但存在潜在风险及用药局限性,效果尚存争议。睾酮替代疗法也是普遍使用的治疗方案,但其安全性仍是医患担忧的主要问题[8-9]。中医药(如五子衍宗丸)干预及治疗效果呈散在性,缺乏大样本、多中心的临床试验研究及临床诊治标准和依据,同时自拟方的安全性及重复性无法得到有效验证[10-11]。虽然辅助生殖技术满足绝大多数少、弱精症的生育需求,但操作要求高、费用高[12]。利勃隆是一种生物提取雄性激素类药,主要成分为睾丸粉,由健康未变质的新鲜或冷冻的牛、羊睾丸制成,临床上主要用于治疗神经衰弱、发育迟缓、阳痿、男子更年期障碍等。目前尚无有关利勃隆治疗少、弱精症的研究。本实验通过研究利勃隆对少精症斑马鱼追尾行为、性腺发育和精子数量的影响,旨在为利勃隆提升男性性功能和治疗少、弱精症的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

利勃隆(批号H11022468)购自北京第一生物化学药业有限公司,根据人用剂量换算[13],用养鱼水配制成20.0 mg/mL母液,现配现用;环磷酰胺(批号A2112310)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司,用养鱼水配制;枸橼酸氯米芬(批号L0807)购自上海塞浦路斯高特制药有限公司,用二甲基亚砜(DMSO)配制成10.0 mg/mL母液,-20 ℃储存备用;五子衍宗丸(批号18035166)购自中国北京同仁堂(集团)有限公司,超纯水配制成6.00 mg/mL母液,-20 ℃储存备用;DMSO(批号BCCD8942)购自德国Sigma公司;GENMED精子活力荧光染色试剂盒(批号H2MT0003)购自上海杰美基因医药科技有限公司。

1.2 主要仪器

网络硬盘录像机(DH-HCVR4104HC-V4)购自浙江大华技术股份有限公司,解剖显微镜(SZX7)购自日本Olympus公司,CCD相机(VertA1)购自上海土森视觉科技有限公司,电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100)购自日本Nikon公司,电子天平(CP214)购自奥豪斯国际贸易(上海)有限公司、高速冷冻离心机(PICO17/21)购自美国Thermo Fisher公司、高速组织研磨器(MY-10)购自拓赫机电科技(上海)有限公司,另有解剖镊、弹簧剪等。

1.3 实验动物与分组

实验前,受精后10月龄(10 mpf)自然成对交配繁殖AB品系雄性斑马鱼(由杭州环特生物养鱼中心提供)饲养于28 ℃的养鱼水中,智能开关控制光照昼夜时间比为14 h∶10 h。每升反渗透水中加入200 mg速溶海盐,电导率为450～550 μS/cm,pH为6.5～8.5,硬度为50～100 mg/L CaCO3。每天常规饲料喂养。饲养管理符合国际实验动物饲养管理评估认证委员会(AAALAC)认证的要求(认证编号001458)。取56尾雄性斑马鱼分为7组,分别为正常组,模型组,2个阳性对照组(枸橼酸氯米芬组、五子衍宗丸组),利勃隆低、中、高浓度组,各组斑马鱼均置于1.2 L “爬坡”交配培养缸(图1)。除正常组外,各组均给予200 μg/mL环磷酰胺配液,每天1次,连续染毒8 d,建立斑马鱼少精症模型。建模第9天开始,按照枸橼酸氯米芬组0.1 μg/mL浓度,五子衍宗丸组6 μg/mL浓度,利勃隆低、中、高浓度组200、300、900 μg/mL浓度给予相应药物,每天1次,持续8 d。期间各组正常喂食。

1：1区;2：2区。

1.4 检测方法

1.4.1追尾频数

模型建立第16天后,捞取正常雌性斑马鱼按1∶1比例置于各组培养缸,镂空隔板隔开雄雌鱼12 h后,拔掉隔板,录像机记录各组雄雌鱼追尾情况：雄鱼频繁将雌鱼由1区经“爬坡”追逐至2区,雌鱼在2区被迫转弯回游,速度下降,雄雌鱼追尾。雄鱼追到雌鱼后头部紧顶着雌鱼腹部的行为即为斑马鱼追尾,追尾频数可反应性行为活跃度,见图1。

1.4.2体长、体重和精巢重量测量

斑马鱼追尾频数统计后,捞取雄性斑马鱼,按组用MS-222麻醉,吸水纸吸去斑马鱼体表水,分别用CCD相机拍照测量体长,电子天平称量体重;在解剖显微镜下,剪开腹腔,取出精巢,放入离心管称重量。

1.4.3精子数量测定

精巢称重量后,研磨、离心取上清液,按照GENMED精子活力荧光染色试剂盒说明书步骤进行精子染色,染色结束后置于荧光显微镜下拍照,每尾斑马鱼观察2个视野。用Image J高级图像处理软件分析并采集数据,统计精子数量。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 利勃隆对斑马鱼追尾的影响

与正常组[(25.33±2.50)次/min]比较,模型组[(2.93±1.28)次/min]斑马鱼追尾频数明显降低(P<0.001);与模型组比较,枸橼酸氯米芬组[(15.67±2.31)次/min,P<0.001]和五子衍宗丸组[(20.87±3.07)次/min,P<0.001],以及利勃隆低[(16.20±1.97)次/min]、中[(21.07±3.06)次/min]、高[(17.00±1.31)次/min]浓度组(均P<0.001)斑马鱼追尾频数均明显升高,其中利勃隆低、中、高浓度组中,以利勃隆中浓度组斑马鱼追尾频数最高,斑马鱼性行为活跃度最明显。

2.2 利勃隆对斑马鱼体长、体重、精巢重量、精子数量的影响

2.2.1利勃隆对斑马鱼体长的影响

与正常组比较,模型组斑马鱼体长明显变短(P<0.001);与模型组比较,枸橼酸氯米芬组(P<0.001)和五子衍宗丸组(P<0.001),以及利勃隆低、中、高浓度组(P<0.001、P<0.001、P=0.002)斑马鱼体长均明显增加(P<0.01),见图2。

a：P<0.001,与正常组比较;b：P<0.01,c：P<0.001,与模型组比较。

2.2.2利勃隆对斑马鱼体重的影响

与正常组比较,模型组斑马鱼体重明显减轻(P<0.001);与模型组比较,枸橼酸氯米芬组(P=0.013)和五子衍宗丸组(P=0.014),以及利勃隆低、中、高浓度组(P=0.004、0.002、0.003)斑马鱼体重均明显增加,见图3。

a：P<0.001,与正常组比较;b：P<0.01,c：P<0.001,与模型组比较。

2.2.3利勃隆对斑马鱼精巢重量的影响

与正常组比较,模型组斑马鱼精巢重量明显减轻(P<0.01);与模型组比较,枸橼酸氯米芬组(P=0.013)和五子衍宗丸组(P=0.021),以及利勃隆低、中、高浓度组(P=0.007、0.006、0.005)斑马鱼精巢重量均明显增加,见图4。

a：P<0.001,与正常组比较;b：P<0.01,c：P<0.001,与模型组比较。

2.2.4利勃隆对斑马鱼精子数量的影响

与正常组比较,模型组斑马鱼精子数量明显减少(P<0.001);与模型组比较,枸橼酸氯米芬组(P=0.040)和五子衍宗丸组(P<0.001),以及利勃隆低、中、高浓度组(P=0.048、P<0.001、P=0.010)斑马鱼精子数量明显增加;利勃隆中浓度组与阳性对照组(枸橼酸氯米芬组和五子衍宗丸组)及利勃隆低、高浓度组间比较,差异也有统计学意义(P<0.001、P=0.003、P<0.001、P<0.001),见图5。

a：P<0.001,与正常组比较;b：P<0.05,c：P<0.01,d：P<0.001,与模型组比较;e：P<0.01,与阳性对照组(枸橼酸氯米芬组和五子衍宗丸组)比较;f：P<0.001,与利勃隆低、高浓度组比较。

3 讨 论

本实验采用环磷酰胺处理雄性斑马鱼,建立斑马鱼少精症模型。环磷酰胺是目前已明确可损害生精功能的化学药物之一,它可杀伤分化中的精原细胞,导致长期无精或少精,是实验采用较多的诱导少、弱精或生殖系统损伤模型的技术。斑马鱼易养殖、性成熟快、易给药、易建模,其基因与人类基因的相似度达87%[14-15],其信号传导通路、生理结构及功能与哺乳动物高度相似[16-17],适合用于人类生殖功能发育和损伤修复研究。利勃隆是一款上市多年的雄性激素类药,用于治疗神经衰弱、发育迟缓、男子更年期障碍等疾病,其富含丰富的蛋白偶联睾酮、精氨酸及各类生化因子和无机元素,起效成分和作用机制目前暂不明确。本研究各项检测指标提示,利勃隆对雄性少精症斑马鱼身体发育(体长、体重)有促进作用,对性行为活跃度(追尾频次)、生殖系统功能(精巢重量、精子数量)有提升作用。与阳性对照组枸橼酸氯米芬和五子衍宗丸相比,精子数量的提升有明显优势。

临床上,大多不育症男性被检查出睾酮水平异常。本课题组前期通过小鼠模型实验证实,利勃隆作为一款纯生物提取生化药品,具有成分复杂、多靶点特点,其所含睾酮成分是以与雄激素结合蛋白结合及游离方式存在,用药后具有快速提升血清睾酮作用。关于内源性睾酮与男性不孕的关系,张枫[3]回顾性分析100例已婚不育男性的临床资料发现,血清中促卵泡生成素和睾酮水平与精子质量密切相关,是导致男性不育的独立风险因素。陈创奇等[18]报道,男性不育症患者血清游离睾酮和生物活性睾酮水平越高,则正常形态精子百分率越高。钟汇等[19]研究发现,检测血清生殖激素水平有利于指导少、弱精症患者的临床诊疗。经对利勃隆活性成分及营养成分定性检测,其还含有大量雄激素结合蛋白及精氨酸等活性成分,且存在许多营养因子和促进睾丸间质细胞活性的成分。作者认为,雄激素结合蛋白能与睾酮结合并有效提高精曲小管内睾酮水平,保证精子生成需要;精氨酸为精子合成的主要原料,对于生精及精子质量提升具有明显效果。睾丸间质细胞是合成与分泌睾酮的主要场所,人体95%的睾酮由睾丸间质细胞合成与分泌[20]。利勃隆中存在的许多营养因子及促进睾丸间质细胞活性的成分,能够促进睾丸间质细胞分泌睾酮,全面改善和提升性腺功能,提升男性的睾丸储备功能和生育能力,改善精子质量和数量[21]。

本研究对利勃隆在促进性行为、性腺发育及精子数量产生的功效及相关成分作用机制进行了初步探索与分析,并利用科学的动物学实验加以证实,但在对该药物中起效成分的定性定量分析、药效评价及其作用机制的研究上,尚未开展实验研究,以上方面将是课题组后续研究的内容。本研究结果为利勃隆老药新用的开发提出了新的研究方向和思路。