灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH文库的构建

孟顺龙 刘涛 宋超

摘要[目的]应用抑制消减杂交（SSH） 技术，建立灭多威胁迫下罗非鱼精巢SSH正反向文库。[方法]以雄性罗非鱼为试验动物，采用抑制性消减杂交技术构建罗非鱼精巢组织在灭多威胁迫下的正反向SSH文库。试验共获得45条EST，成功注释25条，其中正向文库13条，反向文库12条。功能明确基因按功能可分为5类，其中催化活性、细胞相关基因表达上调，细胞过程、结构分子活性相关基因表达下调。整合素β1表达量上调，丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3、Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖体蛋白L22表达下调。[结论]研究结果可为揭示灭多威对罗非鱼生殖毒性的分子机制奠定基础。

关键词 灭多威；罗非鱼；抑制消减杂交；cDNA文库；精巢

中图分类号 S965.125 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）22-0074-04

Abstract[Objective]To construct forward and reserve libraries of suppression subtractive hybridization（SSH） in the testis of male tilapia under the stress of methomyl by using SSH technology.[Method]Using male tilapia as test animal，the forward and reserve libraries of SSH in the testis of tilapia under the stress of methomyl were constructed by using SSH technology.[Result]45 expressed sequence tags （ESTs） were obtained，and 25 expressed sequence tags were successfully noted，including 13 forward libraries and 12 reserve libraries.The genes with confirmed functions were classified into 5 types.Related genes with catalytic activity and cell were upregulated，while related genes with structural molecules activity and biological process were downregulated.The expression amount of integrin β1 was upregulated，while serine/threonine protein kinase pim3，Ca2+ATPase，Na+K+ATPase and ribosomal protein L22 were downregulated.[Conclusion]The research results could lay the foundation for revealing the molecular mechanism of methomyls reproductive toxicity to tilapia.

Key words Methomyl； Tilapia； Suppression subtractive hybridization； cDNA library； Testis

滅多威属于氨基甲酸酯类广谱杀虫剂，具有较强的触杀和胃毒作用，无内吸传导作用，是目前使用最广泛的杀虫剂之一。1997年世界野生动物基金会将灭多威列为雌激素类内分泌干扰物[1]，其对环境的生物毒性表现为破坏动物间的捕食关系，威胁生态系统平衡等[2]。由于灭多威在水中溶解性强、使用量大，加上工农业生产中的不合理排放，导致在一些水体和食品[3]中检测到灭多威残留。目前，灭多威由于在环境水体中检出率高和具有内分泌干扰作用等特点而受到广泛关注[4-6]。

抑制性消减杂交（SSH）是具有选择扩增目的基因功能的差减技术[7]。丰度不同的序列能够通过该技术将其相对含量最终达成一致，然后运用链内退火时优先于链间的原理，使引物与非目的序列片段两端无法结合配对，抑制非目标序列片段，从而扩增了目的基因。与其他差异基因获得方法相比，该技术具有灵敏度高、假阳性低、特异性强等特点，使其用于筛选和克隆差异表达基因。笔者以雄性罗非鱼为试验动物，采用抑制性消减杂交技术构建了罗非鱼精巢组织在雌激素类农药灭多威胁迫下的正反向SSH文库，鉴定罗非鱼精巢组织在雌激素类农药灭多威胁迫下差异表达基因，旨在为揭示灭多威对罗非鱼生殖毒性的分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以雄性尼罗罗非鱼（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴养殖基地）作为试验动物，平均体质量为（112.24±9.48） g，平均体长为（17.06±0.91） cm。在容积300 L（实际水体200 L）的水族缸中随机放入雄性罗非鱼30尾，驯养4周。驯养期间，每天08：00投喂饲料1次，投喂量按罗非鱼体质量的2%计算。暗光比为12 h∶12 h。用空气压缩机进行充氧。

1.2 试验用水

试验用水为曝气7 d的去氯自来水，水温（25.0±0.5） ℃，溶氧量6.3～7.0 mg/L，pH为（7.0±0.5），试验用水符合渔业水质标准（GB11607—89）。

1.3 主要试剂和仪器

1.3.1 主要试剂。质量分数大于97%的灭多威原药，购自上海焦点生物技术有限公司；Oligotex mRNA试剂盒、Maxi Plasmid 试剂盒均购自Qiagen公司；1 kb DNA Ladder、UltraPure Agarose购自Zrbiorise公司；Taq DNA聚合酶、10 mmol/L dNTP 购自TaKaRa公司；TRIzol Reagent提取试剂盒购自Invitrogen公司；RT Enzyme购自ABI公司；PCR-Select cDNA Subtraction 试剂盒购自Clonetech公司。

1.3.2 主要仪器。台式高速冷冻离心机（Eppendorf，Centrifuge 5810R）；电转化仪（BTX，ECM630）；PCR仪（Bio-rad，MyCycler）；电泳仪（Tanon，HE-120）；凝胶成像仪（Tanon，2500）。

1.4 试验设计

根据前期急性试验结果（灭多威的96 h LC50为430 μg/L）、在自然水体中灭多威残留量（0～97 μg/L）[8-10]以及美国水质标准规定灭多威最高限量（200 μg/L）[11]，试验采用5个浓度梯度：0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L。每个浓度梯度设置3个平行，在300 L水族缸中配制上述各浓度染毒液200 L，每个平行随机放入健康雄性罗非鱼20尾。采用半静态水接触染毒法进行试验，各浓度组水缸每天更换50%的水，并添加药物至原浓度。试验期48 d，前30 d为灭多威暴露试验阶段，后18 d为清水恢复试验阶段（无灭多威）。

为测定各试验组灭多威的实际含量，参照张学健等[12]以及张冰等[13]的方法进行测定，灭多威浓度分别为0、0.2、2.0、20.0、200.0 μg/L的试验组最初染毒时的灭多威含量分别为0、0.23、2.12、21.50、182.00 μg/L，24 h后各浓度组灭多威含量为0、0.21、1.92、18.52、179.00 μg/L。24 h后各浓度组与染毒时的灭多威浓度相差不大。

1.5 样品采集

在染毒的第30天对200 μg/L灭多威处理组以及对照组罗非鱼进行样品采集。采样前24 h，停止喂食。试验期间，罗非鱼活跃、健康。采样时，用250 mg/L MS-222麻醉罗非鱼，对其体长和体重进行测定，迅速将罗非鱼处死后采集精巢，置于RNAlater保存液中，最后在-80 ℃超低温冰箱中贮存备用。

1.6 总 RNA 提取和mRNA的分离

取出超低温冰箱中保存的样品，将其研成粉末。采用TRIzol Reagent提取试剂盒提取罗非鱼精巢组织总RNA，具体操作按照TRIzol Reagent提取试剂盒说明书进行。用乙醇将总RNA沉淀后，溶于DEPC处理水中，检测总RNA质量和浓度。样本mRNA经Oligotex mRNA试剂盒分离并纯化，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.7 SSH文库的构建

SSH文库的构建采用PCR-Select cDNA Subtraction 试剂盒，将纯化的mRNA反转录成cDNA，加入反转录酶到cDNA第一链合成中，用E.coli的DNA聚合酶I进行第二链的合成。 以灭多威处理组精巢组织双链 cDNA和对照组双链cDNA互为驱动方或实验方，分别构建SSH正反向文库。将试验方双链cDNA 分成2份，分别与Adaptor 1和 Adaptor 2R相连接。成功连接后，将实验方cDNA同驱动方cDNA一起进行2次分子杂交，杂交产物再进行2次特异PCR。PCR产物进行T/A克隆，取文库菌液50 μL，涂于具有相应抗性的平板上，37 ℃下培育过夜，通过菌落PCR筛选阳性克隆，保存菌种。鉴定菌落以M13 F 和 M13 R 为引物，采用PCR 法鉴定阳性克隆。PCR反应程序如下：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸 5 min，反应体系为20 μL，4 ℃下保存PCR产物。随机挑选64个阳性克隆进行测序。

1.8 序列比对

去除EST有效序列载体以及接头序列后，与GenBank数据库进行相似性比对，分析对比序列所具有的功能。

2 结果与分析

2.1 总 RNA 提取 使用TRIzol Reagent试剂盒，提取灭多威处理组和对照组的罗非鱼精巢组织总RNA，并进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测。从图1可以看出，18S和28S两条清晰条带均位于1 000 bp以上，无基因组污染，即提取的RNA质量较好。

2.2 双链 cDNA 的合成与酶切

电泳检测罗非鱼双链cDNA（图2），并且将Rsa I酶切前后的双链 cDNA条带进行对比，发现Rsa I酶切后的片段明显变小，条带下移，酶切效果好，能够满足后续用于构建文库的试验要求。

2.3 差异片段阳性克隆的筛选

将消减杂交后的片段连接到pMD18T载体上，构建了灭多威胁迫下罗非鱼精巢组织正反向消减cDNA文库。随机挑取36个阳性克隆进行PCR筛选鉴定，对PCR产物进行电泳，结果如图3所示。由图3可知，重组率大于95%，载体中的片段长度为100～500 bp。

2.4 阳性克隆测序及分析

随机挑选64个阳性克隆进行测序，得到45条EST，将测序成功的序列除去载体和接头序列，最后进行GenBank数据库同源性比对，对相同序列进行对比和拼接后成功注释得到25条基因序列，其中正向文库13条，反向文库12条。功能确定基因序列结果如表1所示。

3 讨论

在该试验雌激素类农药灭多威胁迫下罗非鱼精巢组织SSH正向文库中，低密度脂蛋白受体、17α-羟化酶/17，20-裂解酶表达量上调。低密度脂蛋白受体（LDLR）是细胞表面糖蛋白，它参与了卵巢、睾丸等甾源性组织的脂蛋白代谢过程。低密度脂蛋白经受体LDLR途径，摄取胆固醇在细胞内用于类固醇激素合成、细胞增殖等。17α-羟化酶/17，20-裂解酶是体细胞色素P450c17酶，在胆固醇合成途径中控制性类固醇激素的合成[14]。对鱼类而言，P450c17酶在精巢中表达较多，而在卵巢中表达较少[15]。鱼类性类固醇激素睾酮、11-酮基睾酮等则是体内胆固醇的衍生物，它们通过影响生精细胞和支持细胞活性，在精子发生过程中起着重要的调节作用[16]。灭多威有环境雌激素内分泌干扰作用[1]，可能對罗非鱼类固醇激素的分泌有影响。孟顺龙[17]研究发现，在高浓度灭多威胁迫下罗非鱼血清睾酮和11-酮基睾酮含量显著降低。在环境雌激素灭多威胁迫下，精巢组织中低密度脂蛋白受体蛋白、17α-羟化酶/17，20-裂解酶表达量上调，可能是因罗非鱼精巢组织脂蛋白代谢或类固醇激素分泌受灭多威的干扰，从而引起机体的反馈机制，使得低密度脂蛋白受体、17α-羟化酶/17，20-裂解酶表达量上调。

黏附连接主要是将相邻的2个细胞通过黏附分子而连接在一起，其中生精细胞则是通过黏附连接与支持细胞相连接。当黏附分子的数量改变或与胞质内的接头蛋白的关系发生改变后，将使得细胞之间的黏附发生改变[18]。在该试验SSH正向文库中，整合素β1表达量上调。整合素α6和整合素β1是生精上皮中2个重要的黏附分子，它们可以在支持细胞表面构成异源二聚体[19]，与精细胞表面层黏连蛋白相互作用，参与构成生精上皮的顶面ES[20]。因此，精巢组织中整合素β1表达上调，可能是因环境雌激素灭多威对罗非鱼精巢组织黏附性造成影响而引起的反馈机制，使得整合素β1表达上调，以维持精巢组织内部结构的稳定。

在罗非鱼精巢组织SSH反向文库中，丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3表達下调。丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3具有磷酸化凋亡蛋白Bad，发送细胞生存信号的生物学作用。线粒体外膜的促凋亡蛋白 Bax 在凋亡蛋白Bad的作用下形成同源二聚体，增加线粒体膜通透性，释放细胞色素Cytc，并激活Caspase，诱发细胞凋亡[21]。Bad的活性形式是非磷酸化的，Bad磷酸化后失去活性，能够抑制细胞凋亡[22-23]。因此，丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3表达下调，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。在该试验SSH反向文库中，质膜Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表达下调。在正常情况下，细胞质膜中离子浓度呈现一种动态平衡状态，能够维持细胞结构、正常生理功能。Ca2+-AT-Pase、Na+-K+-ATPase对细胞内膜结构上Ca2+、Na+、K+离子稳态具有重要的调节作用，它们在主动运输中具有特定的离子运载功能，以维持组织或器官细胞膜上离子平衡。在灭多威胁迫下，Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase表达下调，这可能影响其对罗非鱼精巢组织细胞膜上离子浓度的调节，导致细胞膜上离子浓度的失衡，影响精巢组织细胞的正常生理功能。

在罗非鱼精巢组织SSH反向文库中，核糖体蛋白L22表达下调。李红艳[24]发现在果蝇胚胎、幼虫S2细胞中敲除 L22对细胞周期产生影响。孙凯等[25]发现L22表达沉默时细胞周期蛋白D1显著降低，相应的细胞增殖受到显著抑制。这说明核糖体蛋白L22与细胞增殖周期有密切联系。因此，在灭多威胁迫诱导糖体蛋白L22表达下调，可能对精巢组织细胞增殖周期造成影响。另外，还有磷脂酶A2差异表达基因下调。磷脂酶A2主要水解甘油磷脂，参与磷脂代谢。磷脂酶A2表达下调，可能影响精巢组织的磷脂代谢过程。

4 结论

采用抑制消减杂交（SSH）技术，构建了罗非鱼精巢组织在雌激素类农药灭多威胁迫下的正反向SSH文库，并获得8条功能确定基因序列。

对部分重要的差异表达基因的鉴定和分析表明，在环境雌激素灭多威胁迫下，罗非鱼精巢组织脂蛋白代谢或类固醇激素分泌受到干扰，引起机体防御机制，诱导低密度脂蛋白受体相关蛋白、17α-羟化酶/17，20-裂解酶表达量上调；诱导整合素β1表达量上调，以维持精巢组织内部结构的稳定；丝/苏氨酸蛋白激酶pim-3表达下调，可能限制凋亡蛋白Bad磷酸化。Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、核糖体蛋白L22表达下调，细胞膜上离子平衡以及精巢组织细胞增殖可能受到影响。

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