神经调节蛋白-1对脓毒症大鼠心肌损伤的作用研究

徐 超,黄 荣,赵鸿雁,曹 静

(新疆医科大学第一附属医院昌吉分院：1.重症医学科;2.心理医学科,新疆昌吉 831110)

脓毒症是指宿主对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍。全球脓毒症每年发病率为189/10万人,脓毒症的病死率为20%～50%,若合并心肌损伤,病死率明显增加[1-3],数据显示脓毒症患者中有40%～50%会发生心肌损伤和心功能不全[4]。有研究指出神经调节蛋白-1(NRG-1)可以调节微血管内皮细胞与心肌细胞间的相互作用[5],包括心脏血管生成、心肌炎症的抑制等,且细胞因子过度产生[6]、炎症反应[7]及心肌凋亡[8]也是脓毒症诱导心肌损伤的潜在分子机制[9]。本研究旨在通过分析NRG-1对脓毒症心肌损伤相关指标的影响,探讨NRG-I对脓毒症心肌损伤的作用,为临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

隔水式恒温培养箱B6-270、烘干箱BXH-280购自上海博迅实业有限公司;漩涡混合器GL-88B购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司;迷你离心机MLX-206购自美国Crystal公司;光学显微镜DM4000购自德国Leica公司;酶标仪K6600A购自北京凯奥科技发展有限公司;高速冷冻离心机H2050R购自湖南湘仪动力测试仪器有限公司;Bio小型垂直电泳及转印装置1645050购自美国Biorad公司;化学发光成像仪WD-9423C购自北京六一生物科技有限公司。

1.2 实验动物、药品与试剂

选用无特定病原体(SPF)级6～8周龄雄性SD大鼠72只,体重200～300 g,大鼠购自新疆医科大学动物实验中心,许可证号SYXK(新)2018-0001。NRG-1(281228)购自美国Abcam公司;肌酸激酶(CK)ELISA试剂盒(BC1145)购自北京索莱宝科技有限公司;肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA试剂盒(H197-1-2)购自南京建成生物工程研究所;超敏肌钙蛋白(cTnⅠ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒(JL50540-96T、JL13202-96T、JL20896-96T)购自上海江莱生物科技有限公司;磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗体(AP0098)、磷酸化糖原合酶激酶3β(p-GSK3β)抗体(bs-2066R)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)蛋白抗体(bs-4563R)、Bax蛋白抗体(bs-0127R)、β-actin抗体(AH11286487)、辣根过氧化物歧化酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(BJ06217694)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1脓毒症模型的建立

采用盲肠结扎穿孔(CLP)法制作大鼠脓毒症模型：术前禁食12 h,不禁水,使用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40 mg/kg),仰卧位固定。右颈外静脉置管用于输液。备皮,消毒后行腹中线切口,长度 1.0～1.5 cm,寻找到盲肠后,移出腹腔,在距根部 1/4 处用 4 号丝线结扎,用 18 号针对穿肠壁刺两次,挤出少量内容物,将肠管回纳入腹腔,使得肠内容物持续溢出,逐层关腹,术后立即皮下注射乳酸钠林格液50 mL/kg,所有大鼠经静脉给予营养支持。术后大鼠放回笼中,自由进食、饮水,保持室温 25 ℃。

1.3.2分组与给药

雄性SD大鼠72只,给予标准饮食和饮水,所有大鼠实验前均给予至少5 d时间适应环境。SD大鼠被分为3组,分别为假手术组(n=24)、脓毒症组(n=24)及脓毒症+NRG组(n=24),以上3组分造模12、24 h两个观察点,每个时间点亚组12只。脓毒症组和脓毒症+NRG组采用CLP法制备大鼠脓毒症模型;假手术组除不进行CLP手术,其他操作和脓毒症组一致。3组大鼠于术前30 min被腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(30 mg/kg)进行麻醉;脓毒症+NRG组麻醉成功后,将其仰卧并固定于鼠板,经腹腔注射重组人NRG(rhNRG,10 μg/kg)。假手术组麻醉成功后于腹腔注射同等体积生理盐水。成功造模12、24 h后,分别取各亚组存活大鼠心脏及外周血清。

1.3.3HE染色观察心脏组织病理形态变化

将上述操作得到的大鼠心脏置于10%甲醛固定7 d后,进行石蜡包埋、切片。二甲苯浸泡20 min脱蜡,梯度乙醇(95%、85%、70%)各浸泡5 min充分水化后,滴加苏木素染色10 min,自来水反蓝5 min。滴加伊红染色3 min,染色完毕后,将组织切片再次进行梯度乙醇(80%、95%、100%)脱水。待组织样本切片干燥后,使用中性树胶封片。100×视野的正置显微镜拍片。

1.3.4ELISA检测血清及心肌组织中心肌酶水平变化

收集各亚组大鼠血清,采用CK、CK-MB、cTnⅠ ELISA试剂盒检测血清中CK、CK-MB、cTnⅠ水平,步骤严格按照检测试剂盒说明书进行。收集各亚组模型大鼠心脏组织,采用TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒检测心肌组织中TNF-α、IL-6水平,步骤参照各试剂盒说明书进行。

1.3.5Western blot检测心肌组织中心肌损伤相关蛋白水平变化

收集各亚组模型大鼠心脏组织,液氮浸泡后研磨,加入预冷组织裂解液(RIPA)裂解,冰上孵育60 min,4 ℃、12 000 r/min离心20 min,取上清液。蛋白定量试剂盒(BCA)进行蛋白定量。Western blot方法检测各亚组心肌组织中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达水平。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠血清CK、CK-MB表达水平比较

造模12、24 h,与假手术组比较,脓毒症组大鼠血清CK、CK-MB表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与脓毒症组比较,脓毒症+NRG组大鼠血清CK、CK-MB表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 各组大鼠血清CK、CK-MB表达水平比较

2.2 大鼠心脏组织HE染色

HE 染色结果显示假手术组大鼠心脏组织未见病理改变,脓毒症组大鼠心脏组织产生明显的病变,可见心脏外膜出血,且造模24 h亚组出血量较造模12 h 亚组多;脓毒症+NRG 组造模12 h 亚组大鼠心脏组织见少量炎性细胞浸润,少量纤维组织增生;脓毒症+NRG组造模24 h 亚组大鼠心脏组织见少量炎性细胞浸润,见图1。

图1 各组大鼠心脏组织病理图(HE染色,100×)

2.3 各组大鼠血清cTnⅠ及心肌组织TNF-α、IL-6的表达水平比较

造模12、24 h,与假手术组比较,脓毒症组大鼠血清cTnⅠ及心肌组织TNF-α、IL-6均升高,差异有统计学意义(P<0.05);与脓毒症组比较,脓毒症+NRG组大鼠血清cTnⅠ及心肌组织TNF-α、IL-6均降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠血清cTnⅠ及心肌组织TNF-α、IL-6的表达水平比较

2.4 各组大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白表达水平比较

Western blot结果显示,造模12、24 h,与假手术组比较,脓毒症组大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β表达水平降低,Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);造模24 h,与脓毒症组比较,脓毒症+NRG组大鼠心肌组织Bax表达水平降低,p-AKT、p-GSK3β表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);造模12、24 h,Bcl-2在各组间差异无统计学意义(P>0.05),见图2,表3、4。

1：假手术组(12 h);2：模型组(12 h);3：模型+NRG组(12 h);4：假手术组(24 h);5：模型组(24 h);6：模型+NRG组(24 h)。

表3 造模12 h时各组大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白条带灰度值

表4 造模24 h时各组大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β、Bcl-2蛋白、Bax蛋白条带灰度值

3 讨 论

脓毒症患者若并发心肌损伤可加重病情,增加死亡率[10],心肌损伤所致心功能不全与脓毒症致死亡率明显相关(70%～90%)[11],因此,脓毒症心肌损伤的治疗非常重要。本课题组前期研究已证实,抑制心肌炎症介质(IL-6、TNF-α)可减轻脓毒症大鼠心肌损伤[12]。且有研究发现在脓毒症休克中,心肌损伤可能是由TNF-α和IL-6的协同作用所致[13]。NRG-1/ErBbs 系统在抑制炎症反应、保护神经功能方面作用极其重要[14-16]。但NRG-1是否通过降低炎症反应保护脓毒症后心肌损伤目前尚不清楚,有待进一步阐明。

近年来越来越多的研究发现,脓毒症大鼠CK、CK-MB及cTnⅠ较健康大鼠明显升高,其中cTnⅠ是预测脓毒症大鼠心肌损伤敏感度和特异度较高的指标,cTnⅠ增高,既可反映缺血性心脏病,也可反映脓毒症性心肌损伤。本研究也在动物模型中证实脓毒症大鼠血清中CK、CK-MB及cTnⅠ水平明显升高,与上述研究一致。脓毒症最主要特征是全身炎症反应,IL-6、TNF-α等炎症指标明显升高,有研究表明炎症因子参与脓毒症心肌损伤的发生、发展[17]。同时,还有研究证实IL-6、TNF-α等炎症因子高低与脓毒症诱导的心肌损伤严重程度密切相关[18],炎症因子也激活炎症细胞促使炎症级联反应。本研究检测了各组大鼠心肌组织中的TNF-α、IL-6的表达水平,显示脓毒症组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-6水平明显增高,提示炎症因子TNF-α、IL-6在脓毒症心肌损伤发生、发展中发挥重要作用,与刘治国等[19]的研究结果一致。

NRG-1是一种主要分布于神经和心血管系统的表皮生长因子样蛋白,其所在信号通路参与多种心脏活动过程,包括心脏血管生成、心肌炎症的抑制等,并在缺血性心肌损伤中减轻心肌微血管内皮损伤、改善心肌缺血达到保护心肌的作用。在心肌损伤时,内皮细胞释放NRG-1,可通过Akt信号通路,抑制细胞色素C的释放和细胞凋亡而保护心肌。本实验对脓毒症模型大鼠进行腹腔注射rhNRG-1,大鼠血清中CK、CK-MB水平明显下降,心脏组织中炎症因子TNF-α、IL-6表达水平明显下降,表明NRG-1抑制了脓毒症大鼠心肌组织中炎症因子的表达,从而减轻了心肌组织的损伤,对改善脓毒症心肌损伤有一定意义,而NRG-1改善脓毒症心肌损伤的机制需进一步研究。

Akt激活是多种生长因子发挥促细胞生存的重要前提,Akt通路在损伤组织的再生、修复、重构和再上皮化中也发挥着关键作用。当Akt磷酸化后激活下游靶向酶标GSK3β使其磷酸化,进而控制下游靶基因影响生命活动[20]。有研究发现,miRNA-214可通过调控Akt通路减轻脓毒症大鼠心肌损伤[21],提示脓毒症心肌损伤的发生可能与Akt通路有关,为进一步证实该推测,本研究检测各组大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β表达水平,发现脓毒症组大鼠心肌中其表达水平较假手术组下调,但给予腹腔注射rhNRG-1处理24 h后,脓毒症大鼠心脏组织中p-Akt、p-GSK3β表达水平上调,表明脓毒症心肌损伤与Akt通路相关,且NRG-1增强了脓毒症大鼠心肌组织中p-Akt、p-GSK3β的表达,抑制了脓毒症大鼠促炎因子TNF-α、IL-6表达,从而减轻了心肌损伤。这可能与Akt信号通路开启或关闭一些下游调控蛋白如GSK3有关,GSK-3β底物又能促进细胞增殖和存活,Akt激活后磷酸化下游靶标,参与了心血管疾病的发生、发展[21]。Bax蛋白是程序性细胞死亡的重要促凋亡介质,属于Bcl-2蛋白家族,通常与抗凋亡分子Bcl-2蛋白相互作用影响细胞凋亡程序[22]。本研究发现脓毒症组大鼠心肌组织中促凋亡因子Bax较假手术组升高,提示脓毒症不仅可造成心肌细胞坏死,影响心脏功能,还可促进心肌细胞凋亡。有研究表明Akt通路可抑制Bax蛋白磷酸化,进而使其失活抑制细胞凋亡[23]。本研究也发现,经腹腔注射rhNRG-1处理后,脓毒症+NRG组大鼠p-Akt表达水平较脓毒症组升高,且Bax蛋白表达水平较脓毒症组降低,从而达到保护心肌的作用。但Bcl-2蛋白的作用在本实验中未得到证实,在后期的实验中作者会持续关注。

脓毒症心肌损伤发病机制复杂,结合前期研究认为是多通路、多因素参与的结果,不能用单一的分子机制或炎症通路解释清楚,本课题组将继续专注于脓毒症心肌损伤机制的研究,为进一步探索脓毒症心肌损伤的治疗提供新思路。